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ki67檢測細胞增殖流式詳細的實驗流程、關鍵步驟及注意事項

更新時間:2025-05-26 點擊次數(shù):0 所屬欄目:行業(yè)信息

  Ki67是一種核蛋白,與細胞增殖密切相關(存在于G1、S、G2和M期,靜止期G0細胞不表達),通過流式細胞術檢測Ki67陽性細胞比例可量化細胞增殖活性。

  一、實驗流程概述

  樣本準備 → 固定 → 透膜 → 抗體染色 → 流式檢測 → 數(shù)據(jù)分析

  二、詳細操作步驟

  1. 樣本制備

  細胞類型:懸浮細胞直接收集;貼壁細胞需胰酶消化(避免過度消化損傷膜表面蛋白)。

  細胞數(shù)量:建議每樣本≥1×10?細胞,確保統(tǒng)計學可靠性。

  對照組設置:

  陰性對照:同型IgG抗體(匹配Ki67抗體種屬和亞型);

  陽性對照:已知高增殖細胞(如激活的淋巴細胞或腫瘤細胞系)。

  2. 固定與透膜

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  乙醇固定可同時透膜,若使用PFA需額外透膜處理;

  透膜時間過長可能導致細胞碎片增多,需優(yōu)化。

  3. 抗體染色

  抗體選擇:

  推薦抗人Ki67抗體(如BD Pharmingen 克隆B56,適用種屬:人、猴);

  種屬匹配二抗(如兔抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488)。

  染色步驟:

  封閉:1% BSA/PBS,室溫30分鐘(減少非特異性結合);

  一抗孵育:Ki67抗體(稀釋比例1:100~1:200),4℃避光1小時;

  洗滌:PBS洗3次,離心300g×5分鐘;

  二抗孵育(間接法需此步):避光室溫30分鐘;

  再次洗滌,重懸于PBS(含1% BSA)。

  4. 流式檢測

  儀器設置:

  激發(fā)/發(fā)射波長:根據(jù)熒光染料選擇(如Alexa Fluor 488→Ex 488 nm/Em 530 nm);

  閾值設定:FSC/SSC排除碎片,調節(jié)電壓使陰性群位于101~102通道。

  數(shù)據(jù)采集:收集≥10,000個細胞事件,保存FCS格式文件。

  5. 數(shù)據(jù)分析

  軟件:FlowJo、FCS Express或BD FACSDiva。

  門控策略:

  FSC-A vs SSC-A:圈定活細胞群,排除碎片;

  單細胞門:FSC-H vs FSC-A去除粘連體;

  熒光通道:對比陰性對照,設門區(qū)分Ki67?(增殖細胞)與Ki67?(靜止細胞)。

  結果輸出:Ki67陽性細胞百分比(%)、平均熒光強度(MFI)。

  三、關鍵注意事項與優(yōu)化

  1. 避免假陽性/假陰性

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  2. 多色Panel設計

  兼容標記:

  細胞周期:與DNA染料(如PI、7-AAD)聯(lián)用,需先固定透膜后染色;

  表面標記:先染表面抗原(如CD3/CD19),再固定透膜染Ki67;

  凋亡檢測:避免與Annexin V(需完整膜結構)同時使用。

  3. 特殊樣本處理

  組織樣本:

  制備單細胞懸液(機械分散+膠原酶消化);

  紅細胞裂解(ACK緩沖液:155 mM NH?Cl, 10 mM KHCO?, 0.1 mM EDTA)。

  冰凍細胞:固定后可用含10% DMSO的凍存液-80℃保存,避免反復凍融。

  四、應用場景與數(shù)據(jù)解讀

  腫瘤研究:Ki67?比例>20%提示高增殖性(如侵襲性淋巴瘤);

  免疫學:評估T/B細胞活化狀態(tài)(如疫苗免疫后增殖水平);

  藥物篩選:對比處理組與對照組Ki67?比例,計算抑制率。

  五、常見問題FAQ

  Q1: Ki67與BrdU檢測有何區(qū)別?

  Ki67:標記所有活躍周期細胞(無需預標記);

  BrdU:需細胞攝入胸腺嘧啶類似物,僅標記S期細胞。

  Q2: 能否與細胞活力染料(如PI)聯(lián)用?

  可以,但需注意PI與紅色熒光通道沖突(建議選用綠色Ki67抗體+PI在FL2/FL3檢測)。

  Q3: 乙醇固定后細胞形態(tài)變化影響FSC/SSC?

  是,乙醇固定會縮小細胞體積(FSC降低),需重新調整電壓和閾值。

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