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Ki67是一種核蛋白,與細胞增殖密切相關(存在于G1、S、G2和M期,靜止期G0細胞不表達),通過流式細胞術檢測Ki67陽性細胞比例可量化細胞增殖活性。
一、實驗流程概述
樣本準備 → 固定 → 透膜 → 抗體染色 → 流式檢測 → 數(shù)據(jù)分析
二、詳細操作步驟
1. 樣本制備
細胞類型:懸浮細胞直接收集;貼壁細胞需胰酶消化(避免過度消化損傷膜表面蛋白)。
細胞數(shù)量:建議每樣本≥1×10?細胞,確保統(tǒng)計學可靠性。
對照組設置:
陰性對照:同型IgG抗體(匹配Ki67抗體種屬和亞型);
陽性對照:已知高增殖細胞(如激活的淋巴細胞或腫瘤細胞系)。
2. 固定與透膜
乙醇固定可同時透膜,若使用PFA需額外透膜處理;
透膜時間過長可能導致細胞碎片增多,需優(yōu)化。
3. 抗體染色
抗體選擇:
推薦抗人Ki67抗體(如BD Pharmingen 克隆B56,適用種屬:人、猴);
種屬匹配二抗(如兔抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488)。
染色步驟:
封閉:1% BSA/PBS,室溫30分鐘(減少非特異性結合);
一抗孵育:Ki67抗體(稀釋比例1:100~1:200),4℃避光1小時;
洗滌:PBS洗3次,離心300g×5分鐘;
二抗孵育(間接法需此步):避光室溫30分鐘;
再次洗滌,重懸于PBS(含1% BSA)。
4. 流式檢測
儀器設置:
激發(fā)/發(fā)射波長:根據(jù)熒光染料選擇(如Alexa Fluor 488→Ex 488 nm/Em 530 nm);
閾值設定:FSC/SSC排除碎片,調節(jié)電壓使陰性群位于101~102通道。
數(shù)據(jù)采集:收集≥10,000個細胞事件,保存FCS格式文件。
5. 數(shù)據(jù)分析
軟件:FlowJo、FCS Express或BD FACSDiva。
門控策略:
FSC-A vs SSC-A:圈定活細胞群,排除碎片;
單細胞門:FSC-H vs FSC-A去除粘連體;
熒光通道:對比陰性對照,設門區(qū)分Ki67?(增殖細胞)與Ki67?(靜止細胞)。
結果輸出:Ki67陽性細胞百分比(%)、平均熒光強度(MFI)。
三、關鍵注意事項與優(yōu)化
1. 避免假陽性/假陰性
2. 多色Panel設計
兼容標記:
細胞周期:與DNA染料(如PI、7-AAD)聯(lián)用,需先固定透膜后染色;
表面標記:先染表面抗原(如CD3/CD19),再固定透膜染Ki67;
凋亡檢測:避免與Annexin V(需完整膜結構)同時使用。
3. 特殊樣本處理
組織樣本:
制備單細胞懸液(機械分散+膠原酶消化);
紅細胞裂解(ACK緩沖液:155 mM NH?Cl, 10 mM KHCO?, 0.1 mM EDTA)。
冰凍細胞:固定后可用含10% DMSO的凍存液-80℃保存,避免反復凍融。
四、應用場景與數(shù)據(jù)解讀
腫瘤研究:Ki67?比例>20%提示高增殖性(如侵襲性淋巴瘤);
免疫學:評估T/B細胞活化狀態(tài)(如疫苗免疫后增殖水平);
藥物篩選:對比處理組與對照組Ki67?比例,計算抑制率。
五、常見問題FAQ
Q1: Ki67與BrdU檢測有何區(qū)別?
Ki67:標記所有活躍周期細胞(無需預標記);
BrdU:需細胞攝入胸腺嘧啶類似物,僅標記S期細胞。
Q2: 能否與細胞活力染料(如PI)聯(lián)用?
可以,但需注意PI與紅色熒光通道沖突(建議選用綠色Ki67抗體+PI在FL2/FL3檢測)。
Q3: 乙醇固定后細胞形態(tài)變化影響FSC/SSC?
是,乙醇固定會縮小細胞體積(FSC降低),需重新調整電壓和閾值。
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