Ki-67是一種在細胞增殖過程中表達的蛋白質，它出現在除了G0期(靜止期)之外的所有細胞周期階段(G1、S、G2和M期)。因此，Ki-67常被用作細胞增殖的標志物，廣泛應用于腫瘤生物學研究、病理診斷以及評估治療反應等領域。檢測Ki-67表達水平可以幫助了解細胞群體的增殖活性。

　　Ki-67細胞增殖檢測方法

　　1. 免疫組織化學染色(IHC, Immunohistochemistry)

　　原理：利用針對Ki-67抗原的特異性抗體對固定后的組織切片或細胞涂片進行染色。

　　操作步驟：

　　樣本準備：制備石蠟包埋的組織切片或細胞涂片，并進行脫蠟處理。

　　抗原修復：由于固定過程可能會掩蓋抗原決定簇，通常需要通過加熱或酶消化來進行抗原修復。

　　阻斷非特異性結合：使用血清或其他封閉劑減少背景染色。

　　一抗孵育：加入Ki-67抗體，讓其與樣品中的Ki-67蛋白結合。

　　二抗孵育：使用標記了酶(如HRP)或熒光基團的二抗來放大信號。

　　顯色/熒光檢測：如果使用的是酶標二抗，則需添加相應的底物(如DAB)產生顏色反應;如果是熒光標記，則直接在熒光顯微鏡下觀察。

　　結果分析：計算陽性細胞占總細胞數的比例(Ki-67指數)，這可以手動完成，也可以借助圖像分析軟件自動計數。

　　2. 流式細胞術(Flow Cytometry)

　　原理：基于流式細胞儀快速分析單個細胞上的熒光標記情況，適用于懸浮細胞或從組織中分離出來的單細胞懸液。

　　操作步驟：

　　細胞準備：收集并固定細胞，必要時進行通透化處理以便抗體進入細胞內。

　　染色：用Ki-67抗體對細胞進行染色。

　　數據分析：通過流式細胞儀獲取數據，根據熒光強度區分陽性細胞和陰性細胞，從而確定Ki-67陽性細胞的比例。

　　3. Western Blot

　　原理：用于檢測細胞或組織提取物中的Ki-67蛋白水平，雖然不能直接給出增殖比例，但能提供關于Ki-67存在與否及其相對量的信息。

　　操作步驟：包括蛋白質提取、電泳分離、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育及化學發光成像等步驟。

　　應用領域

　　腫瘤學研究：Ki-67指數是評估腫瘤惡性程度的重要指標之一，高Ki-67指數往往提示更差的預后。

　　藥物療效評價：在臨床試驗中，監測Ki-67的變化可用于評估抗癌藥物的效果。

　　基礎科學研究：幫助理解正常生理狀態下細胞增殖調控機制。