琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase, SDH)是線粒體內(nèi)膜上的關(guān)鍵酶，參與三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈。其提取與活性測定需嚴格保持酶穩(wěn)定性，以下為詳細實驗方案：

　　一、SDH提取步驟(以動物肝臟為例)

　　1. 材料與試劑

　　樣本：新鮮動物肝臟(如大鼠肝臟)

　　提取緩沖液：

　　0.25 M 蔗糖

　　10 mM Tris-HCl(pH 7.4)

　　1 mM EDTA

　　0.1% BSA(減少酶失活)

　　1 mM PMSF(蛋白酶抑制劑)

　　設(shè)備：勻漿器、低溫離心機、超聲破碎儀

　　2. 操作流程

　　組織處理：

　　取1 g肝臟，冰上剪碎，加入10 mL預(yù)冷提取緩沖液;

　　4℃下勻漿(3×10秒，間隔30秒冰浴)。

　　差速離心：

　　低速離心：1000×g，10分鐘(4℃)，棄沉淀(細胞碎片、核);

　　高速離心：10,000×g，20分鐘(4℃)，沉淀為線粒體粗提物。

　　線粒體純化：

　　沉淀重懸于提取緩沖液，超聲破碎(30%功率，5秒×3次，冰浴);

　　加入0.2% Triton X-100(破膜)，冰上靜置10分鐘;

　　12,000×g離心15分鐘，上清即為SDH粗酶液。

　　二、SDH酶活測定(分光光度法)

　　1. 反應(yīng)原理

　　SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，同時將電子傳遞至人工受體(如DCPIP)，通過監(jiān)測DCPIP在600 nm處吸光度下降速率反映酶活性。

　　2. 試劑配制

　　反應(yīng)緩沖液(pH 7.4)：

　　50 mM 磷酸鉀緩沖液

　　20 mM 琥珀酸鈉(底物)

　　0.1 mM DCPIP(電子受體)

　　0.1 mM 甲硫唑(抑制復(fù)合體III，避免電子傳遞干擾)

　　終止液：1% SDS(終止反應(yīng))

　　3. 測定步驟

　　反應(yīng)體系(總體積1 mL)：

　　操作流程：

　　預(yù)溫反應(yīng)混合液至30℃;

　　加入酶液啟動反應(yīng)，立即混勻;

　　每隔30秒記錄600 nm處吸光度(A???)，持續(xù)3分鐘;

　　加入100 μL終止液終止反應(yīng)。

　　空白對照：

　　以熱滅活酶液(沸水浴5分鐘)替代活性酶液，其他步驟相同。

　　4. 酶活計算

　　參數(shù)說明：

　　ΔA600?/min：每分鐘吸光度變化(空白校正后);

　　d：比色皿光徑(cm，通常1 cm);

　　V總?：反應(yīng)總體積(mL);

　　V酶?：酶液體積(mL)。

　　三、關(guān)鍵注意事項

　　酶穩(wěn)定性：

　　全程冰上操作，SDH粗酶液分裝后-80℃保存(避免反復(fù)凍融);

　　添加EDTA和BSA可減少金屬離子和蛋白酶的影響。

　　反應(yīng)優(yōu)化：

　　底物濃度：預(yù)實驗確定z適琥珀酸鈉濃度(通常10~50 mM);

　　抑制劑對照：加入5 mM丙二酸(SDH競爭性抑制劑)，驗證反應(yīng)特異性。

　　干擾排除：

　　線粒體提取時避免過長時間超聲(導(dǎo)致酶失活);

　　確保DCPIP避光保存，防止自身還原。

　　四、常見問題與解決

　　五、應(yīng)用示例

　　藥物毒性評價：檢測線粒體抑制劑(如魚藤酮)對SDH活性的影響;

　　疾病模型研究：比較腫瘤組織與正常組織SDH活性差異(如SDH缺陷型癌癥)。