番紅-固綠(軟骨)染色法的染色原理在于嗜堿性的軟骨和堿性染料番紅O結合呈現紅色，嗜酸性的骨和酸性染料固綠結合而成綠色或者藍色，與呈現紅色的軟骨對比鮮明，從而將軟骨組織和骨組織區分開。番紅O是一種結合多陰離子的陽離子染料，其顯示軟骨組織是基于陽離子染料與多糖中陰離子基團(硫酸軟骨素或硫酸角質素)結合。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關系，間接反映基質中蛋白多糖的含量和分布。當軟骨收到損傷時，軟骨中的糖蛋白會釋放出來，使基質成分分布不均勻，從而導致番紅O淡染或不著色。通過圖像分析軟件可以對番紅O染色的軟骨基質進行定量分析。固綠與膠原纖維結合，不宜褪色。