熒光原位雜交技術是一種重要的非放射性原位雜交技術,原理是利用報告分子(如生物素、地高辛等)標記核酸探針,然后將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交,若兩者同源互補,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。此時可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經熒光檢測體系在鏡下對待DNA進行定性、定量或相對定位分析。
1. 送樣要求
1. 包埋:石蠟包埋、OTC包埋。
(1) 標本要求:已固定在4%多聚甲醛中的動物組織,或已固定在FAA中的植物組織。
(2) 送樣要求:
a. 動物組織:處死動物后立即取材,生理鹽水沖洗表面,4%的多聚甲醛固定,一般組織固定48h左右進行包埋z好,大小不超過1cm*1cm*0.5cm,裝組織的管子一定要比組織大,固定液是樣品體積的5倍以上,以保證充分固定,封口膜封好避免運輸過程中固定液灑出。
b. 植物組織:新鮮取材后固定于FAA固定液中,大小不超過1cm*1cm*0.5cm,如果組織懸浮于固定液上,可以抽真空使其下沉。
注:常溫或少量冰袋運輸。
2. 切片:石蠟切片、冰凍切片。
(1) 標本要求:已包埋的動物/植物組織 。
(2)送樣要求:
a. 石蠟包埋的組織:冰袋運輸。
b. OTC包埋的組織:干冰運輸。
3. 染色:脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片。
(1) 標本要求:切片。
(2) 送樣要求:
a. 石蠟切片:石蠟切片碼齊裝在塑料切片盒中,冰袋運輸。
b. 冰凍切片:冰凍切片碼齊裝在塑料切片盒中,干冰運輸。
4. 拍照:光學拍照(白光)、數字掃描(白光)
(1) 標本要求:已染色的切片。
(2) 送樣要求:已染色的切片,常溫或少量冰袋運輸。
油菜花蕾:
1、原位雜交雜交液作用
(1)雜交液內除含一定濃度的標記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。 (2)雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。 (3)甲酰胺可使雜交溫度降低,所以雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。 (4)硫酸葡聚糖能與水結合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達到提高雜交率的目的。
2、原位雜交探針濃度
(1)探針濃度依其種類和實驗要求略有不同,一般為0.5—5.0 ug/ml(0.5—5.0 ng/ ul)。
(2)適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。
(3)探針的長度一般應在50-300個堿基之間,z長不宜超過400個堿基。
(4)探針短易進入細胞,雜交率高,雜交時間短。