多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)是一種廣泛存在于植物、真菌和某些動物中的銅依賴性酶，它能夠催化酚類物質的氧化反應，生成醌類化合物，進而導致褐變現象。這種酶在食品科學、植物病理學以及生物技術等領域中具有重要意義。測定PPO活性對于了解其在不同條件下的作用機制及調控策略至關重要。

　　常用測定方法

　　1. 分光光度法

　　這是常用的PPO活性測定方法之一，基于PPO催化的底物氧化過程中吸光度的變化來定量酶活性。

　　原理：PPO催化特定底物(如鄰苯二酚、兒茶素或L-多巴等)發生氧化反應，生成有色產物(如醌)。通過測量該產物在特定波長下的吸光度變化率，可以推算出PPO的活性。

　　步驟：

　　準備酶提取液：通常需要將新鮮組織(如水果、蔬菜)勻漿后離心得到上清液作為酶源。

　　設定反應體系：向含有適當緩沖液的試管中加入適量的底物溶液，并迅速加入一定量的酶提取液開始反應。

　　監測吸光度：立即使用分光光度計在合適的波長下(根據所選底物的不同而異，例如420 nm用于鄰苯二酚)連續記錄吸光度隨時間的變化。

　　數據分析：計算吸光度變化的初始速率，并據此確定PPO的活性單位。

　　2. 比色法

　　比色法也是一種常見的PPO活性測定手段，特別適合于大規模篩選實驗。

　　原理：與分光光度法類似，但更側重于z終產物的顏色深淺來進行半定量分析。

　　步驟：基本步驟與上述分光光度法相同，但在終點時僅需測量一次吸光度值，然后與標準曲線對比以估算酶活性。

　　3. 高效液相色譜法(HPLC)

　　當需要對PPO催化產物進行精確鑒定時，HPLC提供了更高的分辨率和準確性。

　　原理：通過高效液相色譜分離并定量分析PPO催化產生的醌類化合物。

　　步驟：首先按照傳統方法制備酶反應混合物，然后取樣進樣至HPLC系統中，利用已知的標準品建立校準曲線，從而計算出樣品中特定醌類化合物的濃度，間接反映PPO活性。

　　注意事項

　　底物選擇：不同的底物會影響PPO活性測定的結果，因此選擇合適的底物非常重要。鄰苯二酚是經典的選擇，但其他底物如L-DOPA也被廣泛應用。

　　pH值控制：PPO的活性強烈依賴于pH值，一般植物來源的PPO在弱酸性到中性范圍內表現z佳，因此需根據具體情況調整緩沖液的pH值。

　　溫度影響：同樣地，溫度也顯著影響PPO活性，通常建議在恒溫條件下進行實驗以保證結果的一致性和可重復性。