微生物群落分析是通過研究特定環境中微生物的組成、結構、功能及其與環境或宿主的相互作用，揭示微生物群落的生態學規律、疾病關聯或工業應用價值的過程。

　　1. 實驗設計與樣本采集

　　樣本類型：環境(土壤、水體)、人體(腸道、口腔)、工業系統等。

　　樣本保存：立即冷凍(-80℃)或使用保存液(如RNAlater)防止DNA降解。

　　重復設置：每組至少3個生物學重復以減少個體差異或環境異質性影響。

　　對照組：根據研究目的設置(如健康vs疾病、處理vs未處理)。

　　2. DNA提取與測序技術

　　DNA提取方法：

　　針對不同樣本類型優化(如土壤需去除腐殖酸，糞便需破壁厚壁菌)。

　　常用試劑盒：PowerSoil(環境樣本)、QIAamp(糞便)。

　　測序技術：

　　16S/18S/ITS rRNA基因測序(物種組成)：

　　靶向可變區(如V3-V4)，引物選擇影響分類分辨率(如515F-806R)。

　　宏基因組測序(物種+功能基因)：

　　全基因組隨機測序，可重建代謝通路(如KEGG、COG)。

　　宏轉錄組/宏蛋白質組(功能活性分析)。

　　3. 生物信息學分析流程

　　原始數據處理：

　　質控：去除低質量序列(Trimmomatic、Cutadapt)。

　　去噪與聚類：DADA2(生成ASV)、UPARSE(生成OTU)。

　　分類學注釋：

　　數據庫：SILVA(16S)、UNITE(ITS)、Greengenes(已停止更新)。

　　工具：QIIME2、MOTHUR、Kraken2。

　　多樣性分析：

　　α多樣性：Shannon指數(多樣性)、Chao1(豐富度)、PD whole tree(系統發育多樣性)。

　　β多樣性：Bray-Curtis(豐度差異)、UniFrac(系統發育距離)。

　　可視化：PCoA、NMDS、熱圖(樣本間相似性)。

　　差異分析：

　　LEfSe(尋找標志物種)、ANCOM(處理成分數據偏倚)、DESeq2(豐度差異檢驗)。

　　功能預測：

　　PICRUSt2(基于16S預測功能)、MetaCyc(通路注釋)。

　　4. 高級分析與應用

　　網絡分析：

　　構建共現網絡(SparCC、CoNet)，識別關鍵物種(hub taxa)。

　　工具：Cytoscape、Gephi。

　　機器學習：

　　隨機森林、支持向量機(SVM)用于疾病診斷或環境預測。

　　多組學整合：

　　關聯代謝組、宿主轉錄組數據(如MMINP、mixOmics)。

　　5. 結果解讀與挑戰

　　關鍵問題：

　　微生物群落是否因處理/疾病顯著改變?

　　哪些物種或功能通路是驅動因素?

　　群落穩定性或功能冗余如何?

　　常見誤區：

　　相關性≠因果關系(需實驗驗證)。

　　測序深度不足導致低豐度物種遺漏。

　　忽略樣本間批次效應(需用ComBat校正)。

　　6. 工具與數據庫推薦

　　分析平臺：

　　QIIME2(全流程)、MEGAN(可視化)、STAMP(統計可視化)。

　　數據庫：

　　NCBI SRA(數據存儲)、MG-RAST(宏基因組分析)、EBI Metagenomics。

　　7. 應用領域

　　醫學：腸道菌群與肥胖、IBD、癌癥的關聯。

　　環境：污染物降解菌群、土壤肥力調控。

　　工業：廢水處理、發酵微生物優化。