考馬斯亮藍法(Bradford法)是一種常用的蛋白質定量方法，基于考馬斯亮藍G-250染料與蛋白質的相互作用引起顏色變化，通過比色法測定蛋白質含量。以下是該方法的關鍵內容：

　　一、原理

　　染料結合機制：在酸性條件下，考馬斯亮藍G-250呈紅色(z大吸收峰465nm);與蛋白質結合后變為藍色(z大吸收峰595nm)。顏色深淺與蛋白質濃度成正比。

　　結合位點：主要與蛋白質中的堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)以及芳香族氨基酸結合。

　　二、實驗步驟

　　試劑配制

　　Bradford工作液：考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%磷酸，定容至1L，過濾后避光保存。

　　標準蛋白溶液：常用牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)配制梯度濃度(如0.2-1.5 mg/ml)。

　　標準曲線制作

　　取不同濃度標準蛋白溶液(如0、10、20…100μl)加入試管，補加緩沖液至相同體積。

　　每管加入5ml Bradford工作液，混勻后靜置5分鐘。

　　測定595nm處吸光度(A595)，繪制標準曲線(濃度 vs. A595)。

　　樣品測定

　　未知樣品與標準品同法處理，根據標準曲線計算蛋白質濃度。

　　三、注意事項

　　靈敏度

　　檢測范圍通常為1-2000 μg/ml，適合微量蛋白質檢測。

　　干擾物質

　　強堿性緩沖液(如Tris、EDTA)、去垢劑(SDS、Triton X-100)、高鹽濃度可能影響結果。

　　解決方法：稀釋樣品或透析去除干擾物。

　　操作要點

　　反應需在5-15分鐘內完成，避免顏色沉淀。

　　混合時避免氣泡，使用相同比色皿以減少誤差。

　　四、優缺點

　　優點：

　　快速(5-10分鐘)、操作簡單、靈敏度高。

　　無需加熱，對還原劑耐受性較好。

　　缺點：

　　不同蛋白質結合能力差異大(如IgG比BSA顯色弱)。

　　高濃度去垢劑或脂類會干擾結果。

　　五、常見問題與解決

　　標準曲線非線性：檢查標準品是否降解，或稀釋是否準確。

　　吸光值過高/低：調整樣品濃度至線性范圍內。

　　顏色不穩定：確保避光操作，嚴格計時。

　　六、應用場景

　　適用于細胞裂解液、純化蛋白、酶活測定等常規定量，但需注意與BCA法或Lowry法互補使用(如含去垢劑時優先選BCA法)。