膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)及腫瘤診斷(如膠質(zhì)瘤)。免疫熒光(Immunofluorescence, IF)是檢測GFAP表達和定位的常用方法，具有高特異性和直觀的細胞/組織成像能力。以下是GFAP免疫熒光測定的詳細流程及優(yōu)化策略。

　　一、實驗原理

　　免疫熒光(IF)通過特異性抗體(一抗)與靶蛋白(GFAP)結(jié)合，再用熒光標記的二抗進行信號放大，z后通過熒光顯微鏡觀察。

　　直接法：熒光標記的一抗直接結(jié)合GFAP(步驟少，但信號較弱)。

　　間接法：未標記的一抗結(jié)合GFAP后，再用熒光二抗檢測(信號更強，常用)。

　　二、實驗材料與設(shè)備

　　三、實驗步驟(間接法)

　　1. 樣本制備

　　細胞樣本：

　　培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞用PBS洗滌。

　　4% PFA固定15-20 min(室溫)。

　　0.1% Triton X-100透化10 min(增強抗體穿透)。

　　組織切片(冰凍/石蠟)：

　　冰凍切片：直接固定后透化。

　　石蠟切片：需脫蠟、水化后再進行抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液，95℃ 10 min)。

　　2. 封閉(減少非特異性結(jié)合)

　　用5% BSA或10% 正常血清(與二抗同源)封閉30 min(室溫)。

　　3. 一抗孵育

　　抗GFAP一抗(1:200-1:1000稀釋，4℃過夜或室溫1-2 h)。

　　PBS洗滌3次(每次5 min)。

　　4. 二抗孵育

　　熒光標記的二抗(如Alexa Fluor 488抗兔，1:500稀釋，避光室溫1 h)。

　　PBS洗滌3次(避光操作)。

　　5. 核染色 & 封片

　　DAPI(1:1000)染核5 min，PBS沖洗。

　　用抗熒光淬滅劑封片，避免氣泡。

　　6. 熒光成像

　　熒光顯微鏡：GFAP(綠色，488nm) + DAPI(藍色，358nm)。

　　共聚焦顯微鏡：更高分辨率，可做3D重建。

　　四、關(guān)鍵優(yōu)化點

　　五、數(shù)據(jù)分析

　　定性分析：觀察GFAP陽性細胞(星形膠質(zhì)細胞)的分布和形態(tài)。

　　半定量分析：

　　使用ImageJ/Fiji測量熒光強度(ROI分析)。

　　比較不同實驗組的平均熒光強度(MFI)。

　　共定位分析：若檢測GFAP與其他蛋白(如Iba1小膠質(zhì)細胞標記)共表達，可用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。