一、測定原理

　　果膠酯酶催化果膠分子中甲氧基(-OCH?)的水解，生成甲醇和游離羧酸基團(果膠酸)?；钚詼y定通過檢測以下任一產物進行：

　　甲醇釋放量(分光光度法或HPLC法)。

　　羧酸基團生成量(pH滴定法或電導率法)。

　　二、常用測定方法

　　1. 滴定法(羧酸基團檢測)

　　原理：果膠酯酶水解果膠產生羧酸，用標準NaOH溶液滴定反應釋放的H?，計算酶活。

　　適用場景：實驗室常規檢測，無需特殊儀器。

　　試劑配制：

　　底物溶液：1% (w/v) 高甲氧基果膠(HM-pectin)溶于0.1 M NaCl溶液(pH 7.0)。

　　緩沖液：0.1 M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4.5~7.5，根據酶z適pH調整)。

　　指示劑：0.1%酚酞乙醇溶液。

　　標準NaOH：0.02 M NaOH溶液(需標定)。

　　步驟：

　　反應體系：

　　試管中加入5 mL底物溶液 + 2 mL緩沖液，37℃預溫5分鐘。

　　加入1 mL酶液(空白對照用煮沸滅活的酶液)，立即混勻并計時。

　　終止反應：10分鐘后加入5 mL沸水浴滅活酶(100℃, 5分鐘)。

　　滴定：冷卻后加入2滴酚酞指示劑，用0.02 M NaOH滴定至粉紅色(pH 8.2)。

　　計算：

　　V：NaOH消耗體積(mL)

　　CNaOH?：NaOH濃度(mol/L)

　　t：反應時間(分鐘)

　　V酶?：酶液體積(mL)

　　定義：1單位(U)為每分鐘釋放1 μmol羧酸基所需的酶量。

　　2. 分光光度法(甲醇檢測)

　　原理：甲醇與酸性高錳酸鉀氧化生成甲醛，再與Nash試劑(乙酰丙酮-銨鹽)顯色，412 nm測定吸光度。

　　優點：靈敏度高，適合微量檢測。

　　試劑配制：

　　Nash試劑：150 g乙酸銨 + 3 mL冰醋酸 + 2 mL乙酰丙酮，定容至1 L(避光保存)。

　　果膠底物：同滴定法。

　　終止液：10% (v/v) 三氯乙酸(TCA)。

　　步驟：

　　反應體系：

　　1 mL底物溶液 + 1 mL緩沖液 + 0.5 mL酶液，37℃反應30分鐘。

　　加入0.5 mL TCA終止反應，離心取上清。

　　顯色反應：

　　取0.5 mL上清 + 0.5 mL 0.1%高錳酸鉀(0.1 M H?SO?配制)→ 室溫靜置10分鐘。

　　加入1 mL Nash試劑 → 60℃水浴15分鐘 → 冷卻后412 nm測吸光度。

　　標準曲線：

　　甲醇標準溶液(0~100 μM)同法處理，繪制吸光度-濃度曲線。

　　計算：

　　C：標準曲線查得甲醇濃度(μmol/mL)

　　V總?：反應液總體積(mL)

　　D：稀釋倍數

　　3. 電導率法(快速檢測)

　　原理：果膠酯酶水解產生羧酸基團，溶液電導率升高，通過電導率變化速率計算酶活。

　　優點：實時監測，無需終止反應。

　　步驟：

　　反應體系：

　　50 mL燒杯中加入20 mL底物溶液(1%果膠 + 0.1 M NaCl)，恒溫磁力攪拌。

　　插入電導電極，記錄初始電導率(G_0G0?)。

　　啟動反應：加入1 mL酶液，連續記錄電導率變化(5分鐘)。

　　計算：

　　ΔG/Δt：電導率變化率(μS/cm/min)

　　k：校準系數(通過標準NaOH滴定確定，通常為1 μS/cm ≈ 0.1 μmol H?)

　　三、注意事項與優化

　　底物選擇：

　　使用高甲氧基果膠(甲氧基含量≥50%)，避免低甲氧基果膠干擾。

　　反應條件控制：

　　溫度波動需<±0.5℃，pH精確校準(果膠酯酶z適pH通常為4.5~7.5)。

　　干擾排除：

　　避免果膠中殘留的酯酶抑制劑(可預透析處理底物)。

　　分光光度法中高錳酸鉀需現配現用，防止氧化失效。

　　四、方法對比

　　五、應用實例

　　食品工業：監測果汁澄清過程中果膠酯酶活性，優化酶解條件。

　　植物生理：分析果實成熟或病原菌侵染時PME活性變化。