一、實驗原理與目的

　　TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色通過標記DNA斷裂的3'-OH末端，特異性檢測凋亡細胞。定量分析旨在計算凋亡細胞比例或凋亡指數，用于評估藥物毒性、疾病模型凋亡程度等。

　　二、圖像采集與預處理

　　1. 圖像獲取規范

　　顯微鏡設置：

　　使用20×或40×物鏡，固定曝光時間(避免過曝)。

　　同一實驗組保持相同熒光通道(如FITC：488nm激發/530nm發射)。

　　樣本要求：

　　每組至少3張切片，每片隨機拍攝5-10個非重疊視野。

　　包含陰性對照(不加TdT酶)與陽性對照(DNase I處理)。

　　2. 圖像預處理(ImageJ)

　　拆分通道：Image → Color → Split Channels，保留TUNEL(綠色)與核染色(DAPI，藍色)。

　　背景扣除：

　　Process → Subtract Background(rolling ball radius=50px)。

　　調整對比度：

　　Image → Adjust → Brightness/Contrast(統一所有圖片對比度范圍)。

　　三、細胞計數與信號量化

　　1. 核分割(DAPI通道)

　　自動計數(適用于密集細胞)：

　　Plugins → Analyze → Cell Counter，手動標記或自動閾值分割：

　　Image → Adjust → Threshold(方法：Otsu，勾選Dark背景)。

　　Analyze → Analyze Particles(Size: 50-Infinity，Circularity: 0.3-1.0)。

　　2. TUNEL陽性信號識別

　　閾值分割：

　　打開TUNEL通道，Image → Adjust → Threshold(建議Huang法，手動微調)。

　　勾選Dark background，應用閾值生成二值圖像。

　　去除噪聲：

　　Process → Noise → Despeckle(去除孤立噪點)。

　　Process → Binary → Watershed(分割粘連信號)。

　　3. 數據導出

　　記錄數值：

　　總細胞數(DAPI計數) = Count from Analyze Particles。

　　TUNEL陽性細胞數 = Count from Threshold后的二值圖像。

　　凋亡率計算：

　　四、高級分析技巧

　　1. 共定位分析(TUNEL與特定標記)

　　插件：Coloc 2(Fiji)或 JACoP。

　　步驟：

　　對齊TUNEL與標記通道(如Caspase-3)。

　　計算Pearson相關系數或Manders重疊系數。

　　2. 信號強度量化

　　測量熒光強度：

　　選中TUNEL陽性區域，Analyze → Measure(記錄Mean Gray Value)。

　　標準化：

　　以陰性對照平均熒光強度為基線，計算相對強度(Fold Change)。

　　五、數據標準化與統計

　　歸一化處理：

　　凋亡率 = (實驗組凋亡率 - 陰性對照凋亡率) / (陽性對照凋亡率 - 陰性對照凋亡率)。

　　統計分析：

　　使用GraphPad Prism進行ANOVA或t檢驗(至少3次獨立實驗)。

　　數據呈現：柱狀圖(均值±SEM)疊加散點圖。

　　六、注意事項與誤差控制