1. CCK8實驗原理與技術創新

　　1.1 基本原理

　　CCK8試劑的核心成分為水溶性四唑鹽(WST-8)，在細胞線粒體脫氫酶的作用下，WST-8被還原為橙黃色水溶性甲臜(Formazan)。甲臜的生成量與活細胞數量呈正相關，通過測定450 nm處的吸光度(OD值)，可定量評估細胞增殖或毒性效應。

　　1.2 技術優勢

　　靈敏度高：WST-8分子量小，穿透細胞能力強，尤其適用于低密度細胞培養。

　　無放射性污染：相較于傳統MTT法，無需使用DMSO溶解甲臜結晶，避免有毒試劑。

　　高通量兼容性：適用于96孔或384孔板，適配自動化檢測設備。

　　實時監測：可在同一培養體系中多次檢測，動態追蹤細胞活性變化。

　　2. 標準化操作流程(SOP)

　　2.1 實驗準備

　　細胞系選擇：根據檢測目標選擇貼壁或懸浮細胞(如HepG2、RAW264.7等)。

　　試劑配制：CCK8試劑避光保存，使用前恢復至室溫。

　　設備校準：酶標儀波長設定為450 nm(參比波長650 nm)。

　　2.2 實驗步驟

　　細胞接種：按梯度密度接種于96孔板(建議每孔5×103~1×10?個細胞)，預培養24 h。

　　加藥處理：設置空白組、對照組及實驗組(含不同濃度待測化合物)，每組設3~6復孔。

　　CCK8孵育：處理結束后，每孔加入10%體積的CCK8試劑，37℃避光孵育1~4 h。

　　OD值測定：酶標儀讀取吸光度，計算細胞存活率：

　　2.3 關鍵質控點

　　細胞狀態：確保接種時細胞處于對數生長期。

　　邊緣效應：培養板邊緣孔用PBS填充，避免蒸發干擾。

　　數據校正：扣除培養基背景值，排除藥物自身吸光影響。

　　3. 應用領域與案例分析

　　3.1 藥物篩選與安全性評價

　　案例：某抗癌藥物研發中，通過CCK8法篩選出IC??為5 μM的先導化合物，顯著抑制肺癌細胞A549增殖(p<0.01)。

　　3.2 納米材料生物相容性評估

　　案例：檢測氧化石墨烯(GO)對L929成纖維細胞的毒性，結果顯示50 μg/mL濃度下細胞存活率>90%，符合醫療器械生物安全性標準(ISO 10993-5)。

　　3.3 化妝品原料毒性檢測

　　案例：評估某新型防腐劑的細胞毒性，EC??值高于歐盟限值(0.1%)，證明其安全性。

　　4. CCK8實驗的局限性與改進策略

　　4.1 局限性

　　代謝干擾：某些化合物可能抑制脫氫酶活性，導致假陰性。

　　成本較高：試劑價格高于MTT法。

　　4.2 優化方向

　　聯用技術：結合LDH釋放實驗或流式細胞術驗證凋亡機制。

　　動態監測：通過多次讀數構建細胞活性時間曲線。