免疫熒光實(shí)驗(yàn)是一種用于研究生物學(xué)中抗原-抗體反應(yīng)的應(yīng)用技術(shù)，它是將熒光色素標(biāo)記到抗體或抗原上，以便在熒光顯微鏡下觀察它們與其他相應(yīng)抗原或抗體的特異性結(jié)合情況，下面就和醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)外包公司e測(cè)試一起看看這個(gè)免疫熒光實(shí)驗(yàn)具體應(yīng)該如何操作吧!

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

　　1、細(xì)胞準(zhǔn)備

　　(1)取出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，消化重懸細(xì)胞。

　　(2)將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。

　　(3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性取適量細(xì)胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培養(yǎng)。

　　2、固定

　　固定的目的，其實(shí)就是為了防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散。

　　(1)取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞3次。

　　(2)每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min，棄去多聚甲醛;

　　(3)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)兩次。

　　3、通透

　　其目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。

　　(1)每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室溫10min，棄去Triton-X100。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)兩次。

　　4、封閉

　　每孔中加入1mL的3%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄封閉液。醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)外包公司提醒：從封閉開(kāi)始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，不然極易產(chǎn)生較高的背景。

　　5、一抗結(jié)合

　　(1)向爬片上滴加稀釋好的一抗，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24 孔板放置于4℃冰箱中，過(guò)夜孵育。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)五次。

　　6、二抗結(jié)合

　　(1)加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)五次。

　　7、DAPI染色

　　(1)按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液，并向每個(gè)孔中加入1mL的DAPI工作液，靜置染色10min，e測(cè)試提醒：注意避光。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)三次。

　　8、封片及檢測(cè)

　　(1)將爬片小心取出，用吸水紙吸干多余液體，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。

　　(2)將爬片倒置載玻片上，周圍涂指甲油固定。

　　(3)4℃暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。