在進行16S rRNA測序時，樣本的降解和污染是兩個常見的問題，它們可能嚴重影響實驗結果的準確性和可靠性。以下是針對這兩個問題的具體處理方法和預防措施：

　　樣本降解的處理

　　1. 預防措施

　　快速處理：采集樣本后盡快進行DNA提取，以減少核酸酶對DNA的降解作用。

　　低溫保存：在運輸和儲存過程中保持樣本低溫(如使用干冰或液氮)，以減緩DNA降解速度。

　　添加保護劑：某些情況下可以在樣本中添加DNA保護劑，如RNAlater等，以穩定核酸。

　　2. 樣本質量評估

　　凝膠電泳檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳檢查提取的DNA完整性，觀察是否有明顯的降解片段。

　　光譜分析：使用分光光度計測量DNA濃度和純度(A260/A280比值)，高質量的DNA應接近1.8-2.0。

　　定量PCR(qPCR)：利用16S rRNA基因特異性引物進行qPCR擴增，評估模板DNA的質量和完整性。

　　3. 數據分析調整

　　選擇合適的區域：如果樣本有一定程度的降解，可以選擇較短的16S rRNA基因可變區進行擴增，例如V4區，因為其長度較短，更易成功擴增。

　　生物信息學修正：在數據分析階段，可以通過去除低質量讀段、截短序列等方式提高數據質量。

　　污染的處理

　　1. 實驗室環境控制

　　分區操作：將DNA提取、PCR擴增和文庫制備等步驟分別在不同的實驗室區域內進行，以避免交叉污染。

　　無菌技術：使用無菌耗材，佩戴手套和口罩，并定期清潔工作臺面和儀器。

　　負對照實驗：每次實驗都設置空白對照(如無菌水作為模板)，用于檢測是否存在外源性污染。

　　2. 樣本采集與處理

　　嚴格采樣流程：確保采樣工具和容器經過充分滅菌，避免從外界引入污染物。

　　重復抽樣：對于關鍵樣本，建議進行多次獨立采樣，以驗證結果的一致性。

　　3. 數據過濾與校正

　　去除污染序列：通過與已知污染數據庫(如Mock社區)比對，識別并去除潛在的污染序列。

　　統計分析修正：在多樣性分析中，可以使用去除低豐度OTU的方法來減輕污染的影響。

　　具體案例及應對策略

　　假設你在分析某個土壤樣本時發現存在顯著的背景噪聲，可能是由于微量污染導致的：

　　首先確認污染來源：檢查實驗過程中的每一步驟，確定污染是否來自樣本采集、DNA提取還是PCR過程。

　　優化實驗設計：增加重復樣本數量，改進實驗操作規范，例如更換試劑批次或采用更嚴格的無菌操作標準。

　　數據分析時排除干擾：利用生物信息學工具對原始數據進行深度清洗，比如使用DADA2或Deblur算法來精q識別和去除污染序列。