免疫熒光實驗是一種用于研究生物學中抗原-抗體反應的應用技術，它是將熒光色素標記到抗體或抗原上，以便在熒光顯微鏡下觀察它們與其他相應抗原或抗體的特異性結合情況，醫學科研實驗外包公司e測試專注醫學科研實驗多年，有著豐富的實驗經驗，下面就和醫學科研實驗外包公司e測試一起看看這個免疫熒光實驗具體應該如何操作吧!

　　免疫熒光實驗操作步驟如下：

　　1、細胞準備

　　(1)取出生長狀態良好的細胞，棄培養基，消化重懸細胞。

　　(2)將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。

　　(3)根據細胞生長特性取適量細胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培養。

　　2、固定

　　固定的目的，其實就是為了防止離體組織自溶抗原擴散。

　　(1)取出細胞，棄去培養基，用PBS洗細胞3次。

　　(2)每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min，棄去多聚甲醛;

　　(3)加入1mL的PBS清洗細胞，重復兩次。

　　3、通透

　　其目的是使抗體進入胞內。

　　(1)每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室溫10min，棄去Triton-X100。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復兩次。

　　4、封閉

　　每孔中加入1mL的3%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄封閉液。醫學科研實驗外包公司e測試提醒：從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，不然極易產生較高的背景。

　　5、一抗結合

　　(1)向爬片上滴加稀釋好的一抗，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24 孔板放置于4℃冰箱中，過夜孵育。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

　　6、二抗結合

　　(1)加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

　　7、DAPI染色

　　(1)按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液，并向每個孔中加入1mL的DAPI工作液，靜置染色10min，醫學科研實驗外包公司e測試提醒：注意避光。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復三次。

　　8、封片及檢測

　　(1)將爬片小心取出，用吸水紙吸干多余液體，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。

　　(2)將爬片倒置載玻片上，周圍涂指甲油固定。

　　(3)4℃暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。