定量實時聚合酶鏈反應(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR)是一種用于檢測和量化DNA或RNA分子數量的強大技術。當應用于RNA時，通常首先將RNA逆轉錄為cDNA，然后通過qPCR對目標基因的表達水平進行定量分析，這種方法稱為反轉錄qPCR(RT-qPCR)。以下是進行轉錄qPCR測定的基本步驟和技術要點：

　　實驗準備

　　1. 樣品收集與處理

　　樣品采集：根據研究目的選擇合適的組織、細胞或液體樣本。

　　RNA提取：使用適當的試劑盒或方法(如TRIzol法、柱純化法等)從樣本中提取總RNA，并確保RNA的質量和完整性。

　　2. RNA質量評估

　　使用分光光度計(如NanoDrop)測量RNA濃度和純度(A260/A280比值應在1.8-2.0之間)。

　　通過瓊脂糖凝膠電泳或生物分析儀檢查RNA完整性。

　　反轉錄過程

　　1. cDNA合成

　　使用逆轉錄酶(如M-MLV或AMV)將mRNA逆轉錄成cDNA。可以采用oligo(dT)引物特異性地反轉錄poly(A)尾的mRNA，或者使用隨機六聚體引物來覆蓋更廣泛的RNA序列。

　　qPCR實驗設計

　　1. 引物設計

　　設計特異性強、擴增效率高的引物對目標基因進行擴增。理想情況下，引物長度應在18-25bp之間，GC含量約為40%-60%，并且避免形成二級結構。

　　對于每個目標基因，建議同時設計一對內參基因(如GAPDH、β-actin等)用于數據標準化。

　　2. qPCR反應體系構建

　　準備含有SYBR Green I或其他熒光染料的預混液，加入適量的cDNA模板、上下游引物及無核酸酶水至推薦體積。

　　每個樣本至少設置三個技術重復以減少實驗誤差。

　　qPCR運行與數據分析

　　1. 程序設置

　　根據所使用的qPCR儀器說明書設定熱循環條件，一般包括預變性(95°C, 10分鐘)，隨后是多個循環(如40次)的變性(95°C, 15秒)、退火(60°C左右, 30秒)及延伸(72°C, 30秒)階段。

　　在每次循環后收集熒光信號以監測產物積累情況。

　　2. 數據分析

　　利用Ct值(Cycle threshold)比較不同樣本間目標基因的相對表達量。ΔΔCt法是常用的相對定量方法之一，通過計算目標基因相對于內參基因的ΔCt值差異來進行歸一化處理。

　　如果需要絕對定量，則可以通過制作標準曲線來確定未知樣品中的基因拷貝數。

　　注意事項

　　在整個實驗過程中應嚴格控制污染，尤其是防止外源性DNA污染影響結果準確性。

　　定期校準儀器并使用高質量的試劑有助于提高實驗的可靠性和重現性。

　　考慮到生物變異，z好在不同條件下多次獨立重復實驗以驗證結論的有效性。