免疫印跡(Western Blot，WB)是一種廣泛應用于分子生物學和生物化學領域的技術，主要用于檢測細胞或組織樣品中特定蛋白質的存在、相對數量及分子量。該方法結合了凝膠電泳分離蛋白質與特異性抗體識別目標蛋白的優點，是研究蛋白質表達水平、翻譯后修飾狀態以及相互作用等的重要工具。

　　免疫印跡測試的基本步驟

　　樣品準備

　　收集細胞或組織樣本，并使用適當的裂解緩沖液將其溶解以釋放蛋白質。

　　對樣品進行定量，確保每孔上樣量一致，以便于比較不同樣品間的蛋白質表達差異。

　　SDS-PAGE電泳

　　將蛋白質樣品加入含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠中，通過電場作用使蛋白質按照其分子大小遷移。

　　一般情況下，較大分子量的蛋白質遷移速度較慢，較小分子量的蛋白質則較快穿過凝膠。

　　轉膜

　　在電泳完成后，將分離后的蛋白質從凝膠轉移到固相支持物(如硝酸纖維素膜或PVDF膜)上。

　　這一過程通常通過電轉移完成，也可以采用毛細管轉移法。

　　封閉

　　為了減少非特異性結合，需用含脫脂奶粉或BSA的緩沖液封閉膜上的未結合位點。

　　一抗孵育

　　使用針對目標蛋白的一級抗體與膜上的蛋白質結合。選擇合適的一抗是實驗成功的關鍵，它決定了特異性和靈敏度。

　　洗滌

　　徹底清洗膜以去除未結合的一抗，防止背景噪音增加。

　　二抗孵育

　　加入標記有酶(如辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP)或熒光標簽的二級抗體，用于放大信號。

　　顯色/發光

　　根據所使用的標記物類型選擇相應的底物進行反應。例如，HRP標記的二抗可與DAB或ECL試劑發生化學發光反應，在X光片上形成圖像;熒光標記則可通過激光掃描儀直接讀取信號強度。

　　數據分析

　　分析結果圖像，確定目標蛋白條帶的位置及其灰度值或發光強度，以此評估目標蛋白在各組樣品中的表達水平。

　　注意事項

　　樣品處理：保持樣品新鮮并盡量避免反復凍融，以免影響蛋白質活性。

　　內參選擇：為保證數據準確性，常選用β-actin、GAPDH等作為內參來校正上樣量差異。

　　抗體選擇：根據物種來源、抗原決定簇位置等因素謹慎挑選適合的一抗和二抗。

　　優化條件：對于不同的蛋白質，可能需要調整電泳時間、電壓，轉膜效率，封閉時間和濃度，抗體稀釋比例等參數。