原位雜交(In Situ Hybridization, ISH)是一種在組織切片中定位特定核酸序列(如mRNA、miRNA或病毒RNA)的技術，適用于研究基因表達的空間分布。以下是針對肝臟切片的詳細實驗流程及注意事項：

　　1. 實驗原理

　　通過標記的核酸探針與組織內互補靶序列雜交，經顯色或熒光檢測，精確定位目標核酸在肝細胞、膽管或非實質細胞(如Kupffer細胞)中的表達位置。

　　2. 實驗材料與試劑

　　樣本：新鮮或凍存的肝臟組織(4%多聚甲醛固定，石蠟包埋或OCT包埋冰凍切片)。

　　探針：地高辛(DIG)或熒光標記的DNA/RNA探針(靶向目標基因，長度建議50-500 bp)。

　　關鍵試劑：

　　蛋白酶K(10-20 μg/mL，用于透化組織)。

　　預雜交液(含Denhardt’s液、鮭魚精DNA、SSC緩沖液)。

　　雜交液(含探針、甲酰胺、硫酸葡聚糖)。

　　抗體與顯色底物(抗DIG-AP/HRP + NBT/BCIP或Fast Red)。

　　儀器：切片機、濕盒、雜交儀、熒光顯微鏡或光學顯微鏡。

　　3. 實驗步驟

　　(1) 樣本制備

　　固定與切片：

　　取新鮮肝臟組織，4%多聚甲醛固定24小時(避免過度固定導致RNA降解)。

　　石蠟切片厚度4-5 μm，或冰凍切片厚度8-10 μm(貼附于防脫載玻片)。

　　脫蠟與水化(石蠟切片)：

　　二甲苯脫蠟(3×5分鐘)→梯度乙醇(100%~70%)→DEPC水洗。

　　(2) 預處理

　　蛋白酶K消化：

　　石蠟切片：37℃蛋白酶K(10 μg/mL)處理10-15分鐘(冰凍切片縮短至5-8分鐘)。

　　目的：增加組織通透性，暴露靶核酸。

　　后固定(可選)：

　　4%多聚甲醛固定5分鐘，防止組織脫落。

　　乙?；幚?降低背景)：

　　0.25%乙酸酐(溶于0.1M Tris-HCl，pH 8.0)浸泡10分鐘。

　　(3) 預雜交與雜交

　　預雜交：

　　滴加預雜交液(100-200 μL/片)，42℃孵育1小時(濕盒內)。

　　雜交：

　　替換為含探針的雜交液(探針濃度0.5-2 ng/μL)，42℃孵育16-18小時(DNA探針)或37℃(RNA探針)。

　　甲酰胺濃度：50%甲酰胺可降低雜交溫度，保護RNA完整性。

　　(4) 洗脫與封閉

　　嚴格洗脫：

　　2×SSC(室溫，5分鐘)→1×SSC(42℃，15分鐘)→0.5×SSC(42℃，15分鐘)。

　　高嚴格性洗脫：0.1×SSC(65℃，10分鐘，僅需低背景時使用)。

　　封閉：

　　滴加1% BSA(溶于TBST)封閉30分鐘，減少非特異性結合。

　　(5) 信號檢測

　　抗體孵育(DIG標記探針)：

　　抗DIG-堿性磷酸酶(AP)抗體(1:500稀釋)，37℃孵育1小時。

　　顯色：

　　NBT/BCIP顯色液：避光顯色10-30分鐘(藍色沉淀)。

　　Fast Red：紅色熒光信號(熒光顯微鏡觀察)。

　　復染與封片：

　　蘇木素復染細胞核(10-30秒)→中性樹膠封片。

　　(6) 對照設置

　　陽性對照：已知高表達靶基因的肝組織切片(如肝臟病毒RNA陽性樣本)。

　　陰性對照：

　　不加探針的雜交液。

　　使用正義鏈探針(檢測反義鏈非特異性結合)。

　　4. 注意事項與優化

　　RNA保護：

　　全程使用DEPC水配制試劑，操作臺RNase-free(乙醇擦拭)。

　　冰凍切片避免反復凍融，固定時間≤24小時。

　　探針設計：

　　避免重復序列或二級結構，探針Tm值應與雜交溫度匹配。

　　RNA探針需體外轉錄純化(避免DNA污染)。

　　背景控制：

　　增加預雜交時間至2小時，或提高洗脫嚴格性(如升高溫度)。

　　肝組織脂質較多，可延長蛋白酶K消化時間(但需防止組織脫落)。

　　信號弱：

　　提高探針濃度(≤5 ng/μL)，延長顯色時間(避免過度背景)。

　　改用酪胺信號放大(TSA)技術增強靈敏度。

　　5. 數據分析

　　定性分析：

　　顯微鏡下觀察信號定位(如肝小葉中央靜脈周圍 vs. 門管區)。

　　半定量分析：

　　使用ImageJ軟件計算陽性信號面積占比或光密度值。

　　多重標記：

　　結合免疫組化(IHC)標記特定細胞類型(如CK19標記膽管上皮細胞)。

　　6. 常見問題與解決

　　7. 應用場景

　　病毒學研究：定位HBV/HCV RNA在肝細胞中的復制位點。

　　代謝調控：分析脂代謝相關基因(如PPARα)的區室化表達。

　　腫瘤微環境：檢測肝癌組織中miRNA的空間分布差異。