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動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外包公司:小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2025-05-06 點(diǎn)擊次數(shù):0 所屬欄目:行業(yè)信息

  碳廓清實(shí)驗(yàn)(Carbon Clearance Assay)是一種經(jīng)典的評(píng)價(jià)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的實(shí)驗(yàn)方法,通過測定小鼠對(duì)靜脈注射碳顆粒的清除速率,反映機(jī)體非特異性免疫功能。以下為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及注意事項(xiàng):

  一、實(shí)驗(yàn)原理

  核心機(jī)制:

  靜脈注射的惰性碳顆粒(如印度墨水)被肝臟、脾臟的巨噬細(xì)胞(庫普弗細(xì)胞)吞噬清除。

  碳顆粒清除速率與巨噬細(xì)胞活性正相關(guān),清除速率快代表吞噬功能強(qiáng)。

  指標(biāo)計(jì)算:

  吞噬指數(shù)(K):表征單位時(shí)間內(nèi)碳顆粒濃度的對(duì)數(shù)下降速率。

  校正吞噬指數(shù)(α):結(jié)合肝脾重量校正個(gè)體差異,更客觀反映吞噬能力。

  二、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:

  健康成年小鼠(如C57BL/6或BALB/c),體重18-22g,雌雄各半或同性別分組。

  分組:空白對(duì)照組、模型組(如免疫抑制造模)、藥物干預(yù)組(每組6-10只)。

  主要試劑:

  碳懸液:印度墨水(原液用生理鹽水稀釋至1:5~1:10,終濃度約16 mg/mL)。

  抗凝劑:1%肝素鈉溶液(用于采血管預(yù)潤)。

  麻醉劑:1%戊巴比妥鈉(按40 mg/kg腹腔注射)。

  儀器:

  分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平、計(jì)時(shí)器、小鼠固定器、微量采血管。

  三、實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 碳懸液制備

  印度墨水原液用生理鹽水稀釋,超聲處理(5 min)使顆粒分散均勻,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

  2. 尾靜脈注射

  小鼠預(yù)熱(37℃ 5 min)擴(kuò)張血管,固定后注射碳懸液(10 mL/kg,即0.1 mL/10g體重)。

  注射技巧:勻速推注,避免局部堆積或滲漏。

  3. 采血與測定

  時(shí)間點(diǎn):注射后第2分鐘(t?)和第10分鐘(t?)分別從眼內(nèi)眥靜脈叢或尾尖采血。

  操作:

  采血20 μL,立即加入2 mL 0.1% Na?CO?溶液中(溶解未吞噬的游離碳顆粒)。

  混勻后靜置10 min,離心(3000 rpm,10 min)取上清。

  用分光光度計(jì)測定600 nm處吸光度(OD值)。

  4. 解剖稱重

  z后一次采血后處死小鼠,取肝臟和脾臟稱重(濕重,精q至0.1 mg)。

  四、數(shù)據(jù)處理

  計(jì)算吞噬指數(shù)(K):

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  意義:K值越大,吞噬能力越強(qiáng)。

  校正吞噬指數(shù)(α):

    微信截圖_20250506151348

  意義:消除肝脾重量差異對(duì)結(jié)果的干擾。

  五、注意事項(xiàng)

  碳懸液質(zhì)量控制:

  需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定z佳稀釋度(OD值在0.3-1.0線性范圍內(nèi))。

  避免反復(fù)凍融,現(xiàn)用現(xiàn)配減少顆粒聚集。

  采血操作要點(diǎn):

  嚴(yán)格控制采血時(shí)間(誤差≤10秒),避免人為誤差。

  采血部位需輪換,防止多次采血導(dǎo)致凝血或組織損傷。

  動(dòng)物福利與倫理:

  麻醉充分,減少小鼠痛苦,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查要求。

  實(shí)驗(yàn)后處死方法需人道(頸椎脫位或過量麻醉)。

  干擾因素控制:

  溫度:實(shí)驗(yàn)室維持25±1℃,低溫會(huì)減緩碳顆粒清除。

  晝夜節(jié)律:統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)時(shí)間段(如上午9-11點(diǎn))。

  六、常見問題與解決

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