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碳廓清實(shí)驗(yàn)(Carbon Clearance
Assay)是一種經(jīng)典的評(píng)價(jià)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的實(shí)驗(yàn)方法,通過測定小鼠對(duì)靜脈注射碳顆粒的清除速率,反映機(jī)體非特異性免疫功能。以下為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及注意事項(xiàng):
一、實(shí)驗(yàn)原理
核心機(jī)制:
靜脈注射的惰性碳顆粒(如印度墨水)被肝臟、脾臟的巨噬細(xì)胞(庫普弗細(xì)胞)吞噬清除。
碳顆粒清除速率與巨噬細(xì)胞活性正相關(guān),清除速率快代表吞噬功能強(qiáng)。
指標(biāo)計(jì)算:
吞噬指數(shù)(K):表征單位時(shí)間內(nèi)碳顆粒濃度的對(duì)數(shù)下降速率。
校正吞噬指數(shù)(α):結(jié)合肝脾重量校正個(gè)體差異,更客觀反映吞噬能力。
二、實(shí)驗(yàn)材料與試劑
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
健康成年小鼠(如C57BL/6或BALB/c),體重18-22g,雌雄各半或同性別分組。
分組:空白對(duì)照組、模型組(如免疫抑制造模)、藥物干預(yù)組(每組6-10只)。
主要試劑:
碳懸液:印度墨水(原液用生理鹽水稀釋至1:5~1:10,終濃度約16 mg/mL)。
抗凝劑:1%肝素鈉溶液(用于采血管預(yù)潤)。
麻醉劑:1%戊巴比妥鈉(按40 mg/kg腹腔注射)。
儀器:
分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平、計(jì)時(shí)器、小鼠固定器、微量采血管。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 碳懸液制備
印度墨水原液用生理鹽水稀釋,超聲處理(5 min)使顆粒分散均勻,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2. 尾靜脈注射
小鼠預(yù)熱(37℃ 5 min)擴(kuò)張血管,固定后注射碳懸液(10 mL/kg,即0.1 mL/10g體重)。
注射技巧:勻速推注,避免局部堆積或滲漏。
3. 采血與測定
時(shí)間點(diǎn):注射后第2分鐘(t?)和第10分鐘(t?)分別從眼內(nèi)眥靜脈叢或尾尖采血。
操作:
采血20 μL,立即加入2 mL 0.1% Na?CO?溶液中(溶解未吞噬的游離碳顆粒)。
混勻后靜置10 min,離心(3000 rpm,10 min)取上清。
用分光光度計(jì)測定600 nm處吸光度(OD值)。
4. 解剖稱重
z后一次采血后處死小鼠,取肝臟和脾臟稱重(濕重,精q至0.1 mg)。
四、數(shù)據(jù)處理
計(jì)算吞噬指數(shù)(K):
意義:K值越大,吞噬能力越強(qiáng)。
校正吞噬指數(shù)(α):
意義:消除肝脾重量差異對(duì)結(jié)果的干擾。
五、注意事項(xiàng)
碳懸液質(zhì)量控制:
需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定z佳稀釋度(OD值在0.3-1.0線性范圍內(nèi))。
避免反復(fù)凍融,現(xiàn)用現(xiàn)配減少顆粒聚集。
采血操作要點(diǎn):
嚴(yán)格控制采血時(shí)間(誤差≤10秒),避免人為誤差。
采血部位需輪換,防止多次采血導(dǎo)致凝血或組織損傷。
動(dòng)物福利與倫理:
麻醉充分,減少小鼠痛苦,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查要求。
實(shí)驗(yàn)后處死方法需人道(頸椎脫位或過量麻醉)。
干擾因素控制:
溫度:實(shí)驗(yàn)室維持25±1℃,低溫會(huì)減緩碳顆粒清除。
晝夜節(jié)律:統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)時(shí)間段(如上午9-11點(diǎn))。
六、常見問題與解決
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