血清轉錄組測序是一種通過高通量測序技術分析血清中游離RNA(如mRNA、miRNA、lncRNA等)的方法，主要用于探索疾病生物標志物、監測疾病進展及研究宿主-病原體互作。由于血清中RNA含量低且易降解，需嚴格優化實驗流程。下面是詳細步驟與技術要點：

　　一、實驗設計要點

　　1. 樣本類型選擇

　　適用場景：

　　液體活檢(如癌癥早期診斷、治療效果監測)。

　　感染性疾病研究(如病毒載量動態、宿主免疫應答)。

　　對照設置：

　　健康對照組與疾病組配對采集(年齡、性別匹配)。

　　采集時間點統一(如治療前、治療后1周)。

　　2. 樣本量計算

　　z低樣本量：每組至少15例(滿足統計學顯著性要求)。

　　重復實驗：技術重復(同一樣本分3次提取)驗證數據穩定性。

　　二、樣本采集與處理

　　1. 采血與分離

　　采血要求：

　　使用無RNA酶采血管(如PAXgene Blood RNA Tube)。

　　采血后室溫靜置30分鐘，4℃離心(2000×g，10分鐘)分離血清。

　　分裝保存：

　　每管分裝200 μL血清，液氮速凍后-80℃保存(避免反復凍融)。

　　2. RNA提取

　　試劑盒選擇：

　　針對游離RNA：Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(回收小RNA)。

　　外泌體RNA：結合超速離心(100,000×g，2小時)或試劑法(ExoQuick)富集外泌體后提取。

　　質量控制：

　　使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA完整性(RIN≥7為佳，但血清RNA通常碎片化嚴重)。

　　Qubit定量(要求總RNA≥1 ng/μL，否則需擴增)。

　　三、文庫構建與測序

　　1. 文庫制備

　　小RNA測序：

　　適用miRNA、piRNA等(18~30 nt)，使用NEBNext Small RNA Library Prep Kit。

　　片段選擇：切膠回收140~160 bp文庫(適配器+插入片段)。

　　全轉錄組測序：

　　針對mRNA、lncRNA，需rRNA去除(如Ribo-Zero Gold Kit)，使用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit。

　　2. 測序策略

　　平臺選擇：

　　Illumina NovaSeq 6000(高深度，推薦PE150)。

　　數據量：

　　小RNA測序：10~20 million reads/sample。

　　全轉錄組測序：50~100 million reads/sample。

　　四、數據分析流程

　　1. 原始數據處理

　　質控過濾：

　　FastQC評估原始數據質量，Trimmomatic去除低質量序列(Phred score<20)。

　　去接頭：Cutadapt去除Illumina適配器。

　　宿主RNA去污染(可選)：

　　比對至宿主基因組(如hg38)，提取未比對序列用于病原體分析。

　　2. 小RNA分析

　　miRNA鑒定：

　　比對至miRBase數據庫(Bowtie2)，定量工具(如miRDeep2)。

　　差異表達：

　　DESeq2或edgeR篩選差異miRNA(|log2FC|>1，FDR<0.05)。

　　3. mRNA/lncRNA分析

　　拼接與注釋：

　　使用STAR比對，StringTie拼接轉錄本，CPC2區分mRNA與lncRNA。

　　功能富集：

　　GO、KEGG分析(DAVID或clusterProfiler)。

　　4. 生物標志物挖掘

　　機器學習建模：

　　隨機森林(Random Forest)或支持向量機(SVM)篩選特征RNA組合。

　　ROC曲線評估診斷效能(AUC>0.8為佳)。

　　五、關鍵挑戰與解決方案

　　六、應用案例

　　癌癥早篩：

　　結直腸癌患者血清中miR-21、miR-92a顯著上調(AUC=0.89)。

　　病毒感染監測：

　　新冠患者血清中宿主基因IFI27、ISG15表達與病毒載量正相關。

　　七、實驗注意事項

　　防污染：

　　實驗全程佩戴手套、口罩，使用RNase Zap擦拭臺面。

　　單獨設置RNA操作區，避免氣溶膠污染。

　　標準化操作：

　　統一采血至檢測時間間隔(如<2小時)，減少RNA降解。

　　數據公開：

　　原始數據上傳至GEO或ENA數據庫(遵循FAIR原則)。