外泌體(Exosomes)是直徑約30-150 nm的細胞外囊泡，攜帶蛋白質、核酸等生物活性分子，其濃度測定是研究外泌體功能、疾病標志物篩選及藥物遞送系統開發的關鍵步驟。以下是常用測定方法及其技術要點：

　　一、常用測定方法

　　1. 納米顆粒追蹤分析(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis)

　　原理：通過激光散射和動態光散射追蹤顆粒布朗運動，計算粒徑分布與濃度。

　　步驟：

　　外泌體樣本用PBS稀釋至合適濃度(通常10?~10? particles/mL)。

　　注入NTA樣品池，調整激光強度和攝像參數。

　　軟件自動分析顆粒運動軌跡，生成濃度(particles/mL)和粒徑分布圖。

　　優點：直接測定顆粒數，無需標記，可區分外泌體與其他顆粒。

　　缺點：設備昂貴，高濃度樣本需稀釋，易受雜質(如蛋白質聚集體)干擾。

　　2. 可調電阻脈沖傳感(qNano/TRPS, Tunable Resistive Pulse Sensing)

　　原理：顆粒通過納米孔時引起電阻變化，根據脈沖信號計算濃度和粒徑。

　　步驟：

　　選擇合適孔徑的納米孔膜(如NP100對應100 nm孔徑)。

　　校準儀器后注入樣本，調整壓力使顆粒逐個通過納米孔。

　　分析脈沖信號強度與頻率，獲得濃度數據。

　　優點：高分辨率(單顆粒水平)，可檢測寬濃度范圍(10?~1012 particles/mL)。

　　缺點：需頻繁校準，納米孔易堵塞，樣本需嚴格純化。

　　3. 蛋白質定量法(BCA/Bradford法)

　　原理：通過測定外泌體總蛋白含量間接反映濃度。

　　步驟：

　　裂解外泌體(如用RIPA緩沖液)。

　　BCA或Bradford試劑與蛋白反應，比色法測定吸光度(562 nm或595 nm)。

　　根據標準曲線(常用BSA)計算總蛋白濃度。

　　優點：操作簡單，成本低。

　　缺點：受樣本純度影響大(如游離蛋白污染)，無法區分外泌體與其他囊泡。

　　4. 流式細胞術(Flow Cytometry)

　　原理：用熒光標記外泌體表面標志物(如CD63、CD9)，通過流式細胞儀檢測信號。

　　步驟：

　　外泌體與熒光抗體(如PE-CD63)孵育。

　　使用高靈敏度流式細胞儀(如Apogee A50)檢測熒光信號。

　　通過微球標準品定量濃度。

　　優點：特異性高，可多標志物分析。

　　缺點：靈敏度受限(需高表達標志物)，設備需特殊配置(如小顆粒檢測模塊)。

　　5. ELISA法

　　原理：通過夾心法檢測外泌體特異性蛋白(如TSG101)含量。

　　步驟：

　　包被捕獲抗體(如抗-CD81)于酶標板。

　　加入外泌體樣本，孵育后洗滌。

　　加入檢測抗體(如生物素化抗-TSG101)和酶標鏈霉親和素，顯色后測定吸光度。

　　優點：高特異性，適合臨床樣本。

　　缺點：僅反映蛋白含量，需已知標志物，無法直接測定顆粒數。

　　二、實驗關鍵注意事項

　　1. 樣本預處理

　　純化要求：

　　避免雜質干擾：超速離心(100,000×g，2小時)或密度梯度離心去除細胞碎片、蛋白質聚集體。

　　驗證純度：透射電鏡(TEM)觀察形態，Western blot檢測標志蛋白(如Alix、HSP70)。

　　保存條件：

　　短期保存：4℃(不超過48小時);長期保存：-80℃(避免反復凍融)。

　　2. 方法選擇依據

　　研究目的：

　　顆粒數測定：優先NTA或qNano。

　　蛋白標志物分析：選流式或ELISA。

　　樣本類型：

　　高純度樣本(如細胞上清)：NTA、qNano。

　　復雜體液(如血漿、尿液)：需結合純化步驟，推薦ELISA或BCA法。

　　3. 數據校正與標準化

　　內標使用：

　　添加已知濃度的熒光微球(如100 nm聚苯乙烯顆粒)校正儀器誤差。

　　跨平臺驗證：

　　聯合兩種方法(如NTA+BCA)提高結果可靠性。

　　4. 常見誤差來源

　　外泌體聚集：超聲處理(冰浴，10-30秒)分散顆粒。

　　背景噪音：空白對照(如PBS)扣除非特異性信號。

　　儀器波動：定期校準設備，控制室溫(避免溫度漂移)。

　　三、前沿技術拓展

　　微流控芯片：集成分離與檢測，實現單外泌體分析(如ExoView平臺)。

　　表面等離子體共振(SPR)：實時監測外泌體結合事件，動態分析濃度變化。

　　數字PCR(dPCR)：通過外泌體攜帶的核酸(如miRNA)拷貝數定量濃度。

　　四、應用場景

　　基礎研究：外泌體分泌機制、細胞間通訊。

　　臨床診斷：癌癥、神經退行性疾病的外泌體標志物篩查。

　　藥物開發：外泌體載藥系統的載藥量與釋放效率評估。

　　外泌體濃度測定需根據實驗目的、樣本類型及設備條件選擇合適方法，并嚴格把控樣本純化和操作標準化。多方法聯合驗證可顯著提升數據可信度，為后續功能研究奠定基礎。