電鏡負染色技術是一種用于增強樣品對比度的透射電子顯微鏡(TEM)樣品制備方法，廣泛應用于病毒、蛋白質、納米顆粒等生物和材料樣品的觀察。以下是詳細的技術步驟和原理：

　　1. 技術原理

　　負染色技術通過在樣品周圍沉積高電子密度的染色劑(如磷鎢酸、醋酸鈾等)，使樣品在透射電鏡下呈現明亮的背景和暗的樣品輪廓，從而增強樣品的對比度和分辨率。

　　2. 試劑與材料

　　染色劑：

　　磷鎢酸(PTA)：2%水溶液，pH 6.0-7.0。

　　醋酸鈾(UA)：1-2%水溶液，pH 4.5-5.0。

　　甲酸鈾：1-2%水溶液。

　　其他材料：

　　透射電鏡載網(如銅網、金網)。

　　支持膜(如碳膜、Formvar膜)。

　　濾紙或吸水紙。

　　微量移液器。

　　3. 實驗步驟

　　3.1 樣品制備

　　樣品稀釋：

　　將待觀察的樣品(如病毒、蛋白質)用緩沖液(如PBS)適當稀釋。

　　支持膜處理：

　　在透射電鏡載網上覆蓋一層支持膜(如碳膜)，確保膜均勻且無破損。

　　3.2 樣品加載

　　用微量移液器取5-10 μL樣品滴加到載網上。

　　靜置1-2分鐘，使樣品吸附在支持膜上。

　　3.3 染色

　　用濾紙吸去多余的樣品液。

　　滴加5-10 μL染色劑(如2%磷鎢酸)到載網上，靜置30秒至1分鐘。

　　用濾紙吸去多余的染色劑，留下薄層染色劑覆蓋樣品。

　　3.4 干燥

　　將載網放置在干燥器中或室溫下自然干燥。

　　確保載網完全干燥后再進行電鏡觀察。

　　4. 電鏡觀察

　　將制備好的載網放入透射電鏡樣品桿。

　　在電鏡下觀察樣品，調整放大倍數和聚焦，獲得清晰的負染色圖像。

　　5. 注意事項

　　染色劑選擇：

　　根據樣品特性選擇合適的染色劑(如磷鎢酸適用于大多數生物樣品，醋酸鈾適用于核酸樣品)。

　　染色時間：

　　染色時間不宜過長，以免染色劑結晶影響觀察。

　　樣品濃度：

　　樣品濃度過高會導致堆積，過低則難以觀察，需適當稀釋。

　　支持膜質量：

　　支持膜應均勻無破損，避免影響成像質量。

　　操作規范：

　　染色劑具有毒性，操作時需佩戴防護裝備。

　　6. 應用

　　負染色技術廣泛應用于：

　　病毒學研究：觀察病毒形態和結構。

　　蛋白質分析：研究蛋白質復合物的組裝和構象。

　　納米材料表征：觀察納米顆粒的形貌和分布。

　　細胞器研究：觀察細胞器的超微結構。

　　7. 優缺點

　　優點：

　　操作簡單，成本低。

　　可顯著提高樣品對比度。

　　適用于多種生物和材料樣品。

　　缺點：

　　染色劑可能影響樣品原始結構。

　　對樣品純度要求較高。

　　無法提供樣品內部結構的詳細信息。