外泌體顆粒數檢測是評估外泌體數量和質量的重要步驟，廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和治療監控。常用的外泌體顆粒數檢測方法及其詳細步驟和注意事項。

　　1. 納米顆粒跟蹤分析(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis)

　　操作步驟：

　　樣品準備：

　　收集樣本：從細胞培養上清液、血清、尿液等來源中收集含有外泌體的樣本。

　　預處理：通過低速離心(如300-500 g，10分鐘)去除大顆粒雜質，然后通過超速離心(如100,000 g，70分鐘)分離外泌體，并用PBS或適當的緩沖液重懸。

　　稀釋：根據需要將樣品稀釋到合適的濃度，以確保每個視野中有適量的顆粒進行追蹤。

　　儀器校準：

　　打開NTA設備并按照操作手冊進行系統校準，包括激光強度、相機設置等。

　　樣品加載：

　　將稀釋后的樣品注入NTA樣品池中，避免產生氣泡。

　　數據采集：

　　開始視頻錄制，系統會自動追蹤每個顆粒的布朗運動軌跡，并計算其粒徑和濃度。

　　建議每個樣品至少記錄三個獨立的視頻片段，以確保結果的可靠性。

　　數據分析：

　　軟件會自動生成顆粒大小分布圖和濃度報告。

　　根據需要對數據進行進一步處理和統計分析。

　　注意事項：

　　確保樣品均勻分散，避免團聚現象。

　　視頻長度通常為30-60秒，可根據實際情況調整。

　　2. 動態光散射(DLS, Dynamic Light Scattering)

　　操作步驟：

　　樣品準備：

　　類似于NTA，收集并處理含有外泌體的樣本，使用適當的緩沖液稀釋至合適濃度(通常在0.1-1 mg/mL之間)。

　　儀器校準：

　　打開DLS儀器，進行必要的校準和背景測量。

　　樣品加載：

　　將稀釋后的樣品加入樣品池中，確保樣品均勻混合。

　　數據采集：

　　運行測量程序，系統會自動記錄散射光信號的變化，并計算出粒子的平均尺寸和多分散性指數。

　　數據分析：

　　分析軟件會生成顆粒大小分布圖和濃度估算值。

　　注意DLS更適合用于較大顆粒的檢測，對于小顆粒(如外泌體)可能不如NTA精確。

　　注意事項：

　　DLS適合快速評估顆粒大小分布，但對于復雜樣品(如多種尺寸的顆粒共存)，其結果可能不夠準確。

　　3. 高靈敏度流式細胞術(Flow Cytometry)

　　操作步驟：

　　樣品準備：

　　收集并處理含有外泌體的樣本，必要時使用熒光標記抗體標記特定表面標志物(如CD63、CD81)以提高檢測特異性。

　　對于高靈敏度流式細胞儀，可以使用微珠標準品來校準檢測范圍。

　　儀器校準：

　　打開流式細胞儀，進行校準，包括激光功率、光電倍增管電壓等參數設置。

　　樣品加載：

　　將標記好的樣品通過流式細胞儀進樣系統，確保樣品均勻流動。

　　數據采集：

　　記錄每個事件的前向角散射光(FSC)、側向角散射光(SSC)及熒光信號。

　　設置合適的閾值以排除背景噪聲。

　　數據分析：

　　使用分析軟件生成直方圖和散點圖，根據熒光強度和散射光特征確定外泌體的數量和純度。

　　注意事項：

　　流式細胞術適合標記特異性外泌體，但需要高質量的標記抗體和優化的實驗條件。

　　需要使用高靈敏度流式細胞儀才能有效檢測納米級顆粒。

　　4. 透射電子顯微鏡(TEM, Transmission Electron Microscopy)

　　操作步驟：

　　樣品準備：

　　收集并處理含有外泌體的樣本，通過超速離心分離外泌體。

　　制備超薄切片，將外泌體滴加到銅網上，負染后干燥。

　　電鏡觀察：

　　將銅網放入透射電鏡中，調整放大倍數和聚焦，找到外泌體顆粒進行觀察和拍照。

　　數據分析：

　　通過圖像分析軟件手動或自動計數外泌體顆粒。

　　注意事項：

　　TEM提供高分辨率的圖像，但樣品制備過程復雜且耗時較長。

　　適用于形態學和結構分析，但不適合大規模定量分析。

　　總結

　　每種方法都有其優缺點，選擇合適的方法取決于你的具體需求和實驗條件：

　　NTA：適合快速、準確地測定外泌體的顆粒數和大小分布。

　　DLS：適合快速評估顆粒大小分布，但對復雜樣品的精度較低。

　　流式細胞術：適合標記特異性外泌體，但需要高靈敏度設備和優化條件。

　　TEM：適合形態學和結構分析，但不適合大規模定量分析。