使用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)拍攝細胞中的線粒體是一項精細且技術要求較高的實驗操作。以下是詳細的步驟和注意事項，幫助你成功地進行這項工作。

　　實驗準備

　　材料與設備

　　樣品：含有線粒體的細胞或組織。

　　試劑：

　　緩沖液(如磷酸鹽緩沖液，PBS)

　　固定劑(如戊二醛、多聚甲醛)

　　脫水劑(乙醇系列)

　　滲透劑(如丙酮)

　　包埋劑(如環氧樹脂)

　　染色劑(如醋酸鈾、檸檬酸鉛)

　　儀器：

　　超薄切片機(Ultramicrotome)

　　透射電子顯微鏡(TEM)

　　離心機

　　冷凍超薄切片裝置(可選)

　　樣品處理步驟

　　1. 取樣與固定

　　取樣：迅速從培養皿或組織中取出所需的細胞或組織樣本，盡量保持其完整性。

　　預固定：將樣本置于4°C預冷的固定液(如2.5%戊二醛+0.1M PBS，pH 7.4)中固定1-2小時。

　　后固定：用1%鋨酸溶液在4°C下固定1-2小時，進一步增強對比度。

　　2. 脫水與滲透

　　脫水：依次使用30%、50%、70%、80%、90%和1百%的乙醇進行梯度脫水，每個濃度處理10-15分鐘。

　　滲透：用丙酮逐漸替代乙醇，z后用包埋劑(如Spurr樹脂)逐步替換丙酮。

　　3. 包埋與聚合

　　包埋：將處理好的樣本放入模具中，加入新鮮配制的包埋劑，確保樣本完全浸沒。

　　聚合：在60°C烘箱中聚合過夜，使樹脂充分硬化。

　　4. 切片與撈片

　　切片：使用超薄切片機將包埋塊切成約60-90納米厚的超薄切片。

　　撈片：用銅網撈起切片，并放置于濾紙上吸去多余液體。

　　5. 染色

　　負染：可選擇性地對某些樣品進行負染處理，以提高圖像對比度。

　　重金屬染色：使用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行雙染，通常分別染色10-15分鐘。

　　透射電鏡觀察

　　1. 樣品裝載

　　將染色后的銅網放置在專用的樣品臺上，確保其穩固且無氣泡殘留。

　　2. 調整與觀察

　　調整參數：根據樣品特性調整加速電壓、放大倍數、聚焦等參數。

　　觀察與記錄：找到感興趣的區域(如線粒體)，調整至最佳成像條件并拍照記錄。

　　注意事項

　　避免污染：在整個過程中要特別注意防止灰塵和其他雜質污染樣品。

　　操作精細：超薄切片過程需要極高的耐心和技巧，建議在有經驗的技術人員指導下進行。

　　安全防護：部分試劑具有毒性，操作時應佩戴手套、護目鏡，并在通風良好的環境中進行。