常?問題與解析

　　Q1：通過Co-IP后WB驗證發(fā)現(xiàn)，沒有想要的?的條帶?

　　A1：1)有可能是樣品被蛋?酶降解，對應的策略是需要添加蛋?酶抑制劑，所有操作保持4℃以下冰上操作并防?凍融。

　　2)有可能是抗體濃度太低導致條帶較淺，則需要調(diào)整IP或WB抗體濃度，必要時設?濃度梯度，摸索最佳濃度。

　　3)抗體親和?太低，選?適合于IP或者WB的抗體。

　　4)有的IP抗體未與磁珠結合，這種情況需選?適合IP的磁珠。

　　5)若Tag未暴露在融合蛋?構象的表?，則需改變Tag融合表達部位。

　　6)裂解液鹽堿度太?，需?低鹽堿度的裂解液。

　　7)抗體選擇不當，更換抗體。

　　Q2：通過Co-IP后WB驗證發(fā)現(xiàn)，雖然可??的條帶，但是背景很?，原因是什么?

　　A2：是由多方面原因造成的：

　　1)由于?特異蛋?結合導致背景?，若要避??特異性蛋?結合，則需要在??清溶液中裂解細胞，且在免疫沉淀前?protein(A/G)珠?預洗，在免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和鹽堿度(?鹽或去垢劑)。

　　2)實驗儀器或試劑被污染，使?潔凈的儀器及試劑。

　　3)轉(zhuǎn)移膜上的?特異吸附導致背景?，實驗操作過程中戴?套，使?鑷?來取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移?。

　　4)制備樣品中可能有不完全溶解的?的蛋?復合體，則在制備樣品后進?短暫超聲處理(3次，每次5秒鐘)，然后離?，取上清后進?后續(xù)試驗。

　　5)洗滌不徹底，則需要多次洗滌，并增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。

　　6)可能有?特異性蛋?吸附于珠?上，則須進?Preclearing以排?特異性吸附。

　　7)抗體本?待異性不好可能導致背景?，則須選擇合適的抗體，可以考慮單抗。

　　8)使?了過多的細胞或組織進?裂解導致背景?，則須減少樣本量，推薦100-500μg細胞裂解液。

　　9)蛋?降解也可能出現(xiàn)?背景的情況，盡量使?新鮮制備的樣品。

　　蛋白質(zhì)和核酸是組成生命的主要生物大分子，它們各自具有其結構特征和特定功能。核酸具有傳遞遺傳信息等功能，而蛋白質(zhì)則貫穿生命的所有生理過程。