一、實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)原理

　　實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是指在PCR體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，z后通過CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。具有PCR技術(shù)快速、靈敏的特點(diǎn)，同時還具有更高的特異性、實(shí)時監(jiān)測和可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。

　　熒光染料法：實(shí)驗設(shè)計簡單(僅需2個引物，無需設(shè)計探針)，初始成本低，靈敏度高，但需要進(jìn)行熔解曲線分析檢驗擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。適用于非特異性檢測(專一性要求不高或高通量檢測)。

　　探針法：有高特異性(引物和探針共同于模板結(jié)合)，高信噪比，能進(jìn)行多重反應(yīng)。但成本高，實(shí)驗設(shè)計繁瑣。適用于擴(kuò)增序列專一檢測。

　　二、qPCR的實(shí)驗流程

　　1、引物設(shè)計

　　引物設(shè)計原理：

　　(1)用于qPCR的引物長度一般在20-25 bp，TM值一般在60℃左右(TM值很重要)。

　　(2)擴(kuò)增的目的片段長度建議在150-250 bp(通常80-300 bp均可，引物二聚體的長度為30-40 bp，因此目的片段長度過低無法跟引物二聚體區(qū)分)。

　　(3)如果文獻(xiàn)中有qPCR的引物報道可以直接采用文獻(xiàn)中的引物序列，也可以自己設(shè)計。常用的引物設(shè)計軟件有Oligo6、Primer Premier等。

　　2、樣本準(zhǔn)備：RNA提取+逆轉(zhuǎn)錄

　　(1)RNA提取與檢測：從生物樣本中提取總RNA，并通過電泳、光譜分析或RNA定量儀等方法檢測其質(zhì)量和濃度。

　　(2)逆轉(zhuǎn)錄(RT)：對于檢測mRNA，需先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，作為后續(xù)qPCR的模板。

　　3、qPCR反應(yīng)體系

　　qPCR反應(yīng)體系構(gòu)建

　　(1)模板：加入適量已知濃度的cDNA或待測DNA模板。? 引物：設(shè)計并添加針對目標(biāo)基因特異性序列的正向和反向引物。

　　(2)熒光檢測體系：根據(jù)所選方法，添加相應(yīng)的熒光染料(如SYBR Green)或熒光探針。

　　(3)酶與緩沖液：包含熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如Taq酶)、Mg離子和其他必要的緩沖成分。

　　(4)水：補(bǔ)足體積至z終反應(yīng)體系。

　　qPCR循環(huán)

　　(1)熱循環(huán)參數(shù)：設(shè)置一系列溫度循環(huán)，包括變性(95°C左右，使DNA變性為單鏈)、退火(不同溫度，使引物與模板結(jié)合)和延伸(72°C左右，合成新鏈)步驟。每個循環(huán)后，儀器記錄熒光信號強(qiáng)度。

　　(2)熔解曲線分析(僅適用于DNA結(jié)合染料法)：在PCR結(jié)束后，通過逐步升高溫度并監(jiān)測熒光信號，得到熔解曲線，用于驗證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和判斷是否存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　4、數(shù)據(jù)分析

　　三、qPCR的結(jié)果展示

　　四、qPCR的常見問題

　　1、實(shí)時熒光定量 PCR 的優(yōu)點(diǎn)包括那些?

　　(1)能夠?qū)崟r監(jiān)控 PCR 反應(yīng)的進(jìn)程;(2)能夠精確測定每個循環(huán)的擴(kuò)增片段數(shù)量，從而對樣本中的起始材料量進(jìn)行準(zhǔn)確定量;(3)具有更大的檢測動態(tài)范圍;(4)在單管中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和檢測，無需 PCR 后處理。

　　2、給我司送樣做qPCR的送樣要求是什么?

　　(1)A：細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、動植物組織等均可寄送，為了b證實(shí)驗要求，樣品數(shù)盡可能準(zhǔn)備充足。

　　注意事項 1. 組織在1-2min內(nèi)完成取材，速凍，并立即放入-80℃或液氮中保存。

　　2. 有條件的話，z好先將樣本在液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。

　　3. 使用的凍存管z好也用DEPC處理。

　　4. 對于組織及細(xì)胞樣本，如果沒有液氮或-80℃冰箱，也可用RNAlater保存，但是組織一定要切成比較小的塊狀，-20℃保存運(yùn)輸。

　　B：細(xì)胞沉淀：細(xì)胞量大于10^6的細(xì)胞/組;細(xì)菌沉淀：細(xì)菌量大于10^8的細(xì)菌/組;

　　C：土壤、污泥樣本：至少10g;

　　D：環(huán)境水樣：至少1L/組，寄送裝有過濾定量水樣的濾膜(4°C)，干燥寄送。

　　如果其他樣品寄送需求，請與工作人員溝通確認(rèn)!

　　(2)待測樣品為RNA樣品及cDNA樣本，RNA濃度不低于200ng/uL，DNA濃度不低于20ng/uL，核酸體積10uL/檢測基因，且樣品接收后需先進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的開展后續(xù)項目(核酸樣本需包裝完整，離心管用封口膜封閉，干冰寄送)。

　　(3)不接受具有致病性的樣品。

　　(4)待測樣品(原始樣品或者RNA或者cDNA，原始樣品可由我們代處理，RNA樣品及cDNA樣本接收后需先進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的開展后續(xù)項目);

　　(5)提供所需的引物/標(biāo)準(zhǔn)品(或平臺代設(shè)計及合成);提供檢測基因的序列和引物序列，若基因序列來自文獻(xiàn)等其他途徑，可以多參考幾組，避免引物特異性不足，延長實(shí)驗周期。

　　(6)其他所涉及的細(xì)胞、試劑盒以及生物耗材等平臺都可以有償提供。

　　3、熔解曲線出現(xiàn)雙峰的原因?

　　引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

　　引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

　　鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

　　模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。

　　4、CT值出現(xiàn)太晚，偏大?

　　擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針;改用三步法進(jìn)行反應(yīng);適當(dāng)降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。

　　PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

　　PCR產(chǎn)物太長: 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

　　5、陰性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增 反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、ddH2O、引物重復(fù)實(shí)驗。反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。 引物二聚體的出現(xiàn)：配合熔解曲線進(jìn)行分析。

　　6、qPCR的相對定量法計算?

　　(1)目的基因Ct值的歸一化：

　　ΔCt(實(shí)驗組)=Ct(實(shí)驗組的目的基因)-Ct(實(shí)驗組的內(nèi)參基因)

　　ΔCt(對照組)=Ct(對照組的目的基因)-Ct(對照組的內(nèi)參基因)

　　(2)實(shí)驗組ΔCt的歸一化：ΔΔCt=各樣本的ΔCt-對照組的ΔCt

　　(3)表達(dá)水平的差異倍數(shù)：2 –ΔΔCT