一、簡介

生物透射電鏡是觀察生物細胞樣品內部形態的重要工具，其電壓在80-120kv可以降低生物樣品因高能電子束輻射而損傷的影響，同時依賴于生物樣品制備技術的發展，如超薄切片技術、負染色技術、冷凍制樣技術、細胞化學技術等，廣泛應用于組織學、細胞學、病毒學、病理學及材料學等多個學科的研究中。

二、制樣流程

1.取材及固定細胞/細菌、組織樣本：細胞團要求至少半個綠豆大小。懸浮培養細胞/細菌，離心收集，棄去培養液，加入2.5%戊二醛，于4°C保存。對于貼壁細胞，先倒去培養液，加入2.5%戊二醛，4°C固定15min，用細胞刮刮下，離心收集（固定液保留），于4°C保存。組織樣本，離體1-3min內取樣，1mm3。如來不及修整組織大小可先于電鏡固定液內固定半小時左右待組織變硬以后再修整組織進行后固定。超出此范圍后組織會無法完全固定，后續實驗無法完成，務必請重視此過程。固定時間：至少4個小時。

2.緩沖液沖洗：用0.1M磷酸漂洗液漂洗4次，每次15min；

3.后固定：用1%的餓酸?0.1M磷酸緩沖液（PH7.2）室溫（20°C）固定2-4小時（固定時間因樣品不同而適當調整）；

4.洗酸：使用PBS緩沖液漂洗3次，每次15min。

5.梯度脫水：  30%乙醇    15min

                      50%乙醇    15min

                      70%乙醇    15min

                      90%乙醇    15min

                     100  %乙醇    20min    2次

                     100  %丙酮    20min    2次

                   （含水量多、細胞膜厚的樣品可適當延長脫水時間）。

6.滲透

                      丙酮：環氧樹脂1：1    1h

                      丙酮：環氧樹脂1：3    3h

                      純環氧樹脂                  12h

7.包埋

   將滲透好的樣品放入膠囊或包埋板中，加入包埋劑環氧樹脂，在 60℃度溫箱中聚合 48 h。

8.超薄切片

  切片厚度：70 nm。

9.雙染色

  鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，室溫染色 15 min），切片室溫干燥過夜。

  由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此生物樣品超薄切片觀察時像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進行電子染色。這里所謂電子染色是根本不同于光學顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽（如鉛鹽、鈾鹽等）與細胞的某些成分或結構結合，由于重金屬對電子散射能力很強，使那些與其結合的結構或成分對電子散射能力增強，從而達到提高樣品本身反差的。目前常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是：超薄切片先檸檬酸鉛染色10分鐘，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用醋酸鈾染色10-30分鐘，雙蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射電鏡觀察。（百度搜索）

10.透射電鏡觀察。

二、制樣視頻

視頻路徑：釘釘云智商學院（付曉陽）