大腸桿菌(Escherichia coli)作為革蘭氏陰性菌的代表，廣泛用于抗菌材料、消毒劑及抗生素的抑菌效能評估。抑菌圈實驗(又稱瓊脂擴散法)通過測量抑菌劑周圍透明區域的直徑，直觀反映其抑制微生物生長的能力。本文基于CLSI(臨床和實驗室標準協會)指南與ISO 20776-1標準，系統解析大腸桿菌抑菌圈實驗的操作流程、數據解讀及質控要點，為抗菌產品研發與效能驗證提供科學依據。

　　一、實驗原理與核心要素

　　1. 基本原理

　　擴散-抑制模型：抑菌劑在瓊脂培養基中擴散，形成濃度梯度，抑制大腸桿菌生長，產生透明抑菌圈。

　　抑菌圈直徑：與抑菌劑濃度、擴散速率及細菌敏感性呈正相關，滿足公式：

　　D = klogC+b

　　(D：抑菌圈直徑;C：抑菌劑濃度;k、b：實驗常數)

　　2. 實驗方法選擇

　　紙片擴散法(Kirby-Bauer法)：適用于液態或可溶固態樣品，標準化濾紙片(直徑6mm)負載待測物。

　　牛津杯法：適合黏稠或難溶樣品，不銹鋼杯(內徑8mm)嵌入瓊脂中加樣。

　　打孔法：直接在瓊脂平板打孔(孔徑5~6mm)注入樣品，成本低但精度稍遜。

　　二、實驗材料與設備

　　菌株與培養基

　　標準菌株：E. coli ATCC 25922(質控菌株，確保實驗可比性)。

　　培養基：Mueller-Hinton Agar(MHA)，pH 7.2~7.4，厚度4mm(誤差±0.5mm)。

　　菌液制備：0.5麥氏比濁度(~1×10? CFU/mL)，生理鹽水稀釋至1×10? CFU/mL。

　　抑菌劑處理

　　液體樣品：過濾除菌(0.22μm濾膜)，梯度稀釋(如100%、50%、25%)。

　　固體樣品：溶解于適宜溶劑(如DMSO、無菌水)，終濃度≤1%(避免溶劑抑菌干擾)。

　　儀器與耗材

　　恒溫培養箱(35±1℃)、游標卡尺(精度0.1mm)、無菌鑷子、牛津杯/濾紙片。

　　三、標準化操作流程

　　1. 實驗步驟

　　平板制備：

　　傾注MHA培養基(15~20mL/平板)，冷卻凝固后表面干燥(37℃孵育30分鐘)。

　　菌液涂布：

　　取100μL稀釋菌液均勻涂布于瓊脂表面，靜置5分鐘吸附。

　　加樣：

　　紙片法：無菌鑷子貼附含樣濾紙片(間距≥24mm，距平板邊緣≥15mm);

　　牛津杯法：輕壓牛津杯至瓊脂表面，注入50μL樣品液，避免溢出。

　　培養與觀察：

　　倒置平板，35℃培養16~18小時，測量抑菌圈直徑(含紙片/牛津杯尺寸)。

　　2. 關鍵控制點

　　培養基厚度均一：厚度偏差>0.5mm可導致擴散速率差異，影響重復性。

　　菌液濃度精準：比濁儀校準后使用，確保菌落數在(50~100)CFU/cm2。

　　擴散時間控制：加樣后平板靜置10分鐘(預擴散)，再移入培養箱。

　　四、結果判讀與效能分級

　　測量方法

　　游標卡尺垂直測量抑菌圈邊緣(以完全抑制區為準，忽略微弱生長區)，取三次測量平均值。

　　邊緣模糊處理：若抑菌圈呈霧狀，以80%抑菌效果處為邊界。

　　效能評價標準

　　MIC關聯分析

　　通過抑菌圈直徑與z小抑菌濃度(MIC)建立回歸曲線，預測未知樣品MIC值(需預先標定)。

　　五、質量控制與疑難解析

　　1. 質控要求

　　陽性對照：0.5μg/mL環丙沙星紙片(E. coli ATCC 25922抑菌圈應為30~40mm)。

　　陰性對照：無菌溶劑(如生理鹽水)應無抑菌圈。

　　重復性：同一樣品三次平行實驗，抑菌圈直徑偏差≤1.5mm。

　　2. 常見問題與對策

　　六、應用場景與實驗拓展

　　抗菌產品研發

　　評估新型抗菌劑(如納米材料、植物提取物)的廣譜抑菌能力。

　　篩選復合配方的協同抑菌效應(多抑菌劑聯合作用)。

　　醫療與日化領域

　　醫用敷料、消毒劑、洗手液的抑菌效能驗證(參照《消毒技術規范》)。

　　化妝品防腐劑效果測試(ISO 11930標準)。

　　環境監測

　　水體、食品加工環境中大腸桿菌的抗菌劑敏感性監測，指導用藥策略。

　　七、技術創新與標準化趨勢

　　自動化測量系統

　　圖像分析軟件(如ImageJ)自動識別抑菌圈邊緣，減少人為誤差。

　　高通量平臺：96孔板同步測試，提升檢測效率。

　　標準化擴展

　　引入CLSI M100文件更新判讀標準，適應耐藥菌株變化。

　　結合qPCR技術檢測抑菌后細菌存活率，驗證抑菌圈結果可靠性。

　　三維抑菌模型

　　構建含生物被膜的瓊脂模型，模擬真實環境中細菌的抑菌響應。