一、RNAscope技術核心優勢

　　RNAscope是Advanced Cell Diagnostics(ACD)開發的第三代RNA原位雜交技術，具有單分子級檢測靈敏度，突破傳統ISH技術的局限：

　　超高特異性：采用ZZ探針設計(雙Z探針)，有效減少非特異性結合

　　單拷貝檢測：可識別<1 copy/cell的RNA分子

　　兼容性強：支持FFPE樣本、冰凍切片及細胞涂片

　　多重檢測：同一組織切片z多同步檢測4種RNA靶標(需配合TSA熒光系統)

　　二、標準操作流程(SOP)與關鍵參數

　　1. 實驗準備階段

　　2. 核心反應流程

　　探針雜交：40℃孵育2小時(Hyb Oven)

　　信號放大：6級級聯放大(AMP1-6，每級15分鐘)

　　顯色檢測：DAB顯色時間2-10分鐘(顯微鏡監控)

　　三、關鍵技術指標與驗證方法

　　1. 質量控制標準

　　陽性對照：選用PPIB/HPRT1等看家基因(信號強度≥3+)

　　陰性對照：DapB探針對照(背景信號≤1+)

　　靈敏度驗證：使用RNAscope陽性對照玻片(ACD 310043)

　　2. 結果判讀標準

　　四、臨床應用場景與典型案例

　　1. 腫瘤精準診斷

　　EBER檢測：鼻咽癌診斷(敏感性98.7%，特異性100%)

　　HER2 RNA表達：乳腺癌靶向治療指導(對比IHC/FISH符合率>95%)

　　PD-L1 mRNA定位：免疫治療療效預測

　　2. 病原體檢測

　　HPV分型：同步檢測16/18/33型(檢出限<10 copies/cell)

　　新冠病毒RNA：組織內病毒定位研究(Autopsy標本驗證)

　　五、常見問題解決方案(FAQ)

　　Q1：信號弱或無信號如何優化?

　　A：分步排查：①延長蛋白酶消化(+5min梯度) ②提高探針濃度(1.5×) ③增加AMP4孵育時間

　　Q2：背景噪音過高如何處理?

　　A：優先調整：①縮短顯色時間 ②增加洗滌次數(3×5min) ③降低探針工作濃度

　　Q3：多重熒光染色如何設置?

　　A：需使用TSA系列試劑盒(Opal 520/570/620/690)，每輪染色后需微波處理(98℃ 15min)剝離抗體