行業(yè)信息
一、紫外分光光度法(推薦方法)
1、實(shí)驗(yàn)原理
CAT催化H?O?分解,導(dǎo)致其在240nm處吸光度下降,通過測定吸光值變化速率計(jì)算酶活性。
2、試劑準(zhǔn)備
50mM PBS緩沖液(pH7.0)
30mM H?O?(現(xiàn)配現(xiàn)用)
酶提取液(含1mM EDTA的PBS)
3、操作步驟
樣品處理:
取0.2g樣品液氮研磨
加入2mL預(yù)冷提取液
4℃ 12,000g離心15min
上清液為酶提取液
反應(yīng)體系(1mL):
3、測定:
立即混勻
240nm處每30s記錄吸光值
連續(xù)測定3min
數(shù)據(jù)處理
CAT活性(U/gFW)=ΔA240×V總/(ε×d×m×V酶)
其中:
ΔA240:每分鐘吸光度變化值
ε=40M?1cm?1(H?O?摩爾消光系數(shù))
d=1cm(比色皿光徑)
m=樣品鮮重(g)
V總=1mL
V酶=20μL
二、高錳酸鉀滴定法
實(shí)驗(yàn)流程
1、反應(yīng)體系:
5mL 0.1M H?O?
1mL酶液
25℃反應(yīng)5min
2、終止反應(yīng):
加入5mL 10% H?SO?
3、滴定:
用0.01M KMnO?滴定至淡粉色
結(jié)果計(jì)算
CAT活性(U/g)=(V空白-V樣品)×C×5/(t×m)
C:KMnO?濃度(mol/L)
t:反應(yīng)時(shí)間(min)
三、氧電極法
操作要點(diǎn)
1、儀器校準(zhǔn):
無氧水(Na?SO?飽和)
空氣飽和水
2、反應(yīng)體系(2mL):
PBS緩沖液
20μL酶液
20μL 30mM H?O?
結(jié)果計(jì)算
CAT活性(U/g)=Δ[O?]×V/m
四、注意事項(xiàng)
1、關(guān)鍵控制點(diǎn):
H?O?需現(xiàn)配現(xiàn)用
酶提取全程保持4℃
反應(yīng)溫度控制在25±0.5℃
2、常見問題:
吸光度變化不明顯:可適當(dāng)增加酶液用量
反應(yīng)速度過快:稀釋酶液或降低H?O?濃度
3、方法選擇建議:
五、應(yīng)用實(shí)例
以小麥葉片CAT測定為例:
取樣:取第3片完全展開葉
提?。喊?:10(w/v)加入提取液
測定:紫外分光光度法
典型結(jié)果:
正常生長:15-20U/gFW
干旱脅迫:25-35U/gFW
注:1U定義為每分鐘分解1μmol H?O?所需的酶量。建議每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù),數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
NEWS
新聞動(dòng)態(tài)service
科研服務(wù)18537125967