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行業(yè)信息

過氧化氫酶(CAT)活性測定方法

更新時(shí)間:2025-03-26 點(diǎn)擊次數(shù):0 所屬欄目:行業(yè)信息

  一、紫外分光光度法(推薦方法)

  1、實(shí)驗(yàn)原理

  CAT催化H?O?分解,導(dǎo)致其在240nm處吸光度下降,通過測定吸光值變化速率計(jì)算酶活性。

  2、試劑準(zhǔn)備

  50mM PBS緩沖液(pH7.0)

  30mM H?O?(現(xiàn)配現(xiàn)用)

  酶提取液(含1mM EDTA的PBS)

  3、操作步驟

  樣品處理:

  取0.2g樣品液氮研磨

  加入2mL預(yù)冷提取液

  4℃ 12,000g離心15min

  上清液為酶提取液

  反應(yīng)體系(1mL):

     微信截圖_20250326161132

  3、測定:

  立即混勻

  240nm處每30s記錄吸光值

  連續(xù)測定3min

  數(shù)據(jù)處理

  CAT活性(U/gFW)=ΔA240×V總/(ε×d×m×V酶)

  其中:

  ΔA240:每分鐘吸光度變化值

  ε=40M?1cm?1(H?O?摩爾消光系數(shù))

  d=1cm(比色皿光徑)

  m=樣品鮮重(g)

  V總=1mL

  V酶=20μL

  二、高錳酸鉀滴定法

  實(shí)驗(yàn)流程

  1、反應(yīng)體系:

  5mL 0.1M H?O?

  1mL酶液

  25℃反應(yīng)5min

  2、終止反應(yīng):

  加入5mL 10% H?SO?

  3、滴定:

  用0.01M KMnO?滴定至淡粉色

  結(jié)果計(jì)算

  CAT活性(U/g)=(V空白-V樣品)×C×5/(t×m)

  C:KMnO?濃度(mol/L)

  t:反應(yīng)時(shí)間(min)

  三、氧電極法

  操作要點(diǎn)

  1、儀器校準(zhǔn):

  無氧水(Na?SO?飽和)

  空氣飽和水

  2、反應(yīng)體系(2mL):

  PBS緩沖液

  20μL酶液

  20μL 30mM H?O?

  結(jié)果計(jì)算

  CAT活性(U/g)=Δ[O?]×V/m

  四、注意事項(xiàng)

  1、關(guān)鍵控制點(diǎn):

  H?O?需現(xiàn)配現(xiàn)用

  酶提取全程保持4℃

  反應(yīng)溫度控制在25±0.5℃

  2、常見問題:

  吸光度變化不明顯:可適當(dāng)增加酶液用量

  反應(yīng)速度過快:稀釋酶液或降低H?O?濃度

  3、方法選擇建議:

     微信截圖_20250326161121

  五、應(yīng)用實(shí)例

  以小麥葉片CAT測定為例:

  取樣:取第3片完全展開葉

  提?。喊?:10(w/v)加入提取液

  測定:紫外分光光度法

  典型結(jié)果:

  正常生長:15-20U/gFW

  干旱脅迫:25-35U/gFW

  注:1U定義為每分鐘分解1μmol H?O?所需的酶量。建議每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù),數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

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