1.包埋：石蠟包埋、OTC包埋。

　　(1)標本要求：已固定在4%多聚甲醛中的動物組織，或已固定在FAA中的植物組織。

　　(2)送樣要求：

　　a. 動物組織：處死動物后立即取材，生理鹽水沖洗表面，4%的多聚甲醛固定，一般組織固定48h左右進行包埋z好，大小不超過1cm*1cm*0.5cm，裝組織的管子一定要比組織大，固定液是樣品體積的5倍以上，以保證充分固定，封口膜封好避免運輸過程中固定液灑出。

　　注：常溫或少量冰袋運輸。

　　2.切片：石蠟切片、冰凍切片。

　　(1)標本要求：已包埋的動物。

　　(2)送樣要求：

　　a. 石蠟包埋的組織：冰袋運輸。

　　b. OTC包埋的組織：干冰運輸。

　　3.染色:

　　a.石蠟切片：

　　1)脫蠟與水化：將石蠟切片放置于60°烤箱烤片30-60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化。依次將其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度(100%、95%、80%、70%)各2min，水洗5min(不要直接對著切片沖洗)。PBS洗3次，3 min/次。

　　2)細胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液(40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2)浸潤切片30min(RT 避光)，降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

　　3)抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原修復(fù)。常用微波修復(fù)，pH 6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù)2次，每次補足液體以免干片。(酶修復(fù)法也是可以的)。PBS洗3次，3 min/次。

　　4)血清封閉：用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點。用油性筆圍繞組織畫圈，并對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃溫箱中30min,用濾紙吸去多余的血清。

　　5)孵育一抗：對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的一抗，4℃過夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。

　　6)孵育二抗：對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

　　7)切片顯色：用DAB顯色10min，顯色液z好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10min內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。

　　8)復(fù)染及封片：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可用蘇木素染色30s，水洗，鹽酸酒精分化2s，流水浸入15min。脫水時，乙醇梯度(由低至高：50%、70%、95%、100%)各2min。二甲苯5min使切片透明化，z后加入中性樹膠封片(一般封片后z好立即拍照，若不能及時拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度)。

　　b. 冰凍切片

　　1)固定冷凍切片組織：立即將粘附冷凍切片組織載玻片放入固定液中固定30s-1min。

　　2)固定后清洗：切片固定后，將載玻片取出，放入自來水中輕輕晃動，完全除去載玻片上的固定液及OCT包埋劑。

　　3)血清封閉：去除組織殘留固定液及包埋劑后，用免疫組化油筆圈定待測組織區(qū)域，并在圈定區(qū)域內(nèi)滴加適量封閉劑孵育 20 s。然后用TBS清洗液洗滌玻片 30 s。

　　4)孵育一抗：去除載玻片上多余的清洗液，對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的一抗，4℃過夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。

　　5)孵育二抗：對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

　　6)滴加DAB：去除載玻片上多余的清洗液，在油筆圈定區(qū)域內(nèi)滴加適量DAB顯色液，并孵育 90 s左右。然后用純水沖洗 10 s。

　　7)復(fù)染及封片：滴加適量蘇木素復(fù)染液，孵育 10 s左右，然后用純水沖洗 10 s。z后進行脫水封片

　　4.拍照：普通熒光拍照、全息數(shù)字掃描。