擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針;改用三步法進行反應;適當降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。

　　PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

　　PCR產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。